粟酒裂殖酵母的转化方法、转化体以及异源蛋白质的制造方法技术

本发明专利技术提供用于获得传代中的维持稳定性更佳且能够稳定地制备目标异源蛋白质的转化体的粟酒裂殖酵母的转化方法。并且，提供基于该方法获得的转化体以及利用该转化体的异源蛋白质的制造方法。利用具有表达盒和重组位点的载体通过同源重组将所述表达盒整合到粟酒裂殖酵母的染色体的转座子基因Ｔｆ２位点的转化方法，所述表达盒包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因以及终止子，所述重组位点与所述粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组。还提供基于该方法获得的转化体以及利用该转化体的异源蛋白质的制造方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的转化方法、转化体以及异源蛋白质的制造方法。
技术介绍
利用转化体制备异源蛋白质的技术在各个产业被广泛应用，所述转化体是利用基因重组技术导入了编码宿主本身无法生产的异源蛋白质的外源基因(异源蛋白质结构基因)的转化体。在这样的异源蛋白质的制造中，尤其是制造来源于真核生物的蛋白质的情况下，认为作为宿主利用属于真核生物的微生物的方法较为理想。尤其是，从酵母中不含有对人体带来不良影响的物质，且其为单细胞而容易操作等方面考虑，开发了很多将酵母用作宿主的表达系统。其中，已知与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等出芽酵母相比，属于裂殖酵母的khizosaccharomyces pombe (下称粟酒裂殖酵母)的细胞周期和染色体结构、RNA 剪接等与动物细胞更为相似，所生成的蛋白质的翻译后修饰也与动物细胞接近，因而可进行更为复杂的翻译后修饰。将粟酒裂殖酵母用作宿主的异源蛋白质的制造中，以往在粟酒裂殖酵母中导入表达载体(该载体具有异源蛋白质结构基因、启动子以及终止子)，使该表达载体以染色体外基因组(质粒)的方式存在。但是，这种情况下，在粟酒裂殖酵母的培养中这些表达载体有可能从细胞脱离而消失，因此，需要利用营养需求性互补或耐药性积极维护质粒。为此，作为更为稳定地生产异源蛋白质的方法，公开了利用通过同源重组将表达载体整合到粟酒裂殖酵母的染色体的转化体的方法。专利文献专利文献1 日本专利特开2000-262^4号公报专利技术概要专利文献1中记载的转化体中，传代超过50代后整合到染色体的表达载体仍以未脱离的状态存在。但是，在工业上制造异源蛋白质时，要求更长时间的连续培养中的异源蛋白质的稳定生成，因此，希望进一步提高转化体在传代中的维持稳定性。因此，本专利技术的目的在于能够获得在传代中的维持稳定性更佳，且可稳定地制备目标异源蛋白质的转化体的粟酒裂殖酵母的转化方法、其转化体以及利用该转化体的异源蛋白质的制造方法为目的。以下表示本专利技术的粟酒裂殖酵母的转化方法、转化体以及利用该转化体的异源蛋白质的制造方法。〔1〕粟酒裂殖酵母的转化方法，它是利用具有表达盒和重组位点的载体通过同源重组将所述表达盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizoasccharomyces pombe)的染色体中的转化方法，所述表达盒包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因以及终止子，所述重组位点与所述粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组，其特征在于，所述重组位点的碱基序列为将实质上具有同一碱基序列的位点作为靶位点且能够与该靶位点进行同源重组的序列，该位点分别存在于所述粟酒裂殖酵母的多个染色体中的各个不同的染色体和/或以其间夹有一个以上的必需基因的方式存在于同一染色体的多个位置。〔 2〕前述〔1〕所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，在粟酒裂殖酵母的染色体中存在 5个以上的所述靶位点。〔3〕前述〔1〕或〔2〕所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，所述靶位点为转座子基因 Tf2中的碱基序列。。〔4〕粟酒裂殖酵母的转化方法，它是利用具有表达盒和重组位点的载体通过同源重组将所述表达盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的染色体的靶位点的转化方法，所述表达盒包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因以及终止子，所述重组位点与所述粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组，其特征在于，所述粟酒裂殖酵母染色体的靶位点为转座子基因Tf2中的碱基序列。〔5〕前述1 4中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，选择在2个以上的所述靶位点上整合有所述表达盒的转化体。〔6〕前述1 5中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，所述载体包含2个以上的表达盒。〔7〕前述1 6中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，进行同源重组后，选择整合于所述染色体的表达盒的总数为3 40个的转化体。〔8〕前述1 7中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法，其特征在于，所述表达盒中的异源蛋白质结构基因的5’末端侧具有在粟酒裂殖酵母内起作用的分泌信号基因。〔9〕由前述1 8中任一项所述的转化方法获得的转化体。〔10〕培养前述9所述的转化体，获取由该转化体产生的异源蛋白质的异源蛋白质的制造方法。(11)在培养液中培养通过前述8所述的转化方法获得的转化体，从所述培养液中获取由该转化体产生的异源蛋白质的异源蛋白质的制造方法。采用本专利技术的粟酒裂殖酵母的转化方法，能够获得传代中的维持稳定性更佳，且可以稳定地制造目标异源蛋白质的转化体。另外，本专利技术的转化体的传代的维持稳定性更佳，能够更加稳定地制造目标异源蛋白质。另外，本专利技术的异源蛋白质的制造方法利用传代的维持稳定性更好的转化体，因此能够更加稳定地制造目标异源蛋白质。附图简要说明附图说明图1是表示Tf2基因的染色体上的分布的示意图。图2是Tf 2整合型载体的结构图。图3是表示整合的拷贝数及其位置的电泳观察图。图4是表示传代50代后的稳定性的对照图。实施本专利技术的方式(宿主)本专利技术的转化体是，通过将粟酒裂殖酵母用作宿主，在该宿主的染色体上整合包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因(编码异源蛋白质的基因)以及终止子的表达盒而获得。本专利技术所使用的粟酒裂殖酵母可以为野生型，根据用途也可以为使特定基因缺失或失活的突变型。作为使特定基因缺失或失活的方法，可采用公知的方法。具体而言，可通过采用拉图尔法(Nucreic Acids Res (2006) 34 :ell和国际公开第2007/063919号文本等中记载)来使基因缺失。也可通过采用诱变剂的突变分离法(酵母分子遗传学实验法，1996年，学会出版中心)、采用PCR(聚合酶链式反应)的随机突变法 (PCR方法及应用(PCR Methods Appl.)，1992年，第2卷，p. 28-33.)等向基因的一部分中引入突变，藉此使该基因失活。作为使特定基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母宿主，例如记载在国际公开第2002/101038号文本，国际公开第2007/015470号文本等。并且，较好是使用作为宿主而使用的粟酒裂殖酵母中具有用于选择转化体的标记物的宿主。例如，较好是使用基于某个基因的缺失而在生长中以特定的营养成分为必要成分的宿主。通过在载体上整合所述缺失的基因(营养需求性互补标记物)，使转化体不具有宿主的营养需求性。通过该宿主和转化体的营养需求性的不同，区别两者而可获得转化体。例如，将使乳清苷酸脱羧酶基因(ura4基因)缺失或失活而形成的尿嘧啶需求性粟酒裂殖酵母作为宿主，利用包含ura4基因(营养需求性标记物)的载体进行转化后，选择尿嘧啶需求性消失了的宿主，藉此获得整合有载体的转化体。宿主中缺失而形成营养需求性的基因只要是能够使用于转化体的选择的基因则不受限于ura4基因，可以为异丙基苹果酸脱氢酶基因(Ieul基因)等。〔载体〕本专利技术的载体具有包含异源蛋白质结构基因、在粟酒裂殖酵母内起作用的启动子和终止子的表达盒，以及与粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组的重组位点。表达盒是指用于表达异源蛋白质结构基因编码的异源蛋白质所需的DNA的组合，包含异源蛋白质结构基因、在粟酒裂殖酵母内起作用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．粟酒裂殖酵母的转化方法，它是利用具有表达盒和重组位点的载体通过同源重组将所述表达盒整合到粟酒裂殖酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）的染色体中的转化方法，所述表达盒包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因以及终止子，所述重组位点与所述粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组，其特征在于，所述重组位点的碱基序列为将实质上具有同一碱基序列的位点作为靶位点且能够与该靶位点进行同源重组的序列，该位点分别存在于所述粟酒裂殖酵母的多个染色体中的各个不同的染色体和／或以其间夹有一个以上的必需基因的方式存在于同一染色体的多个位置。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：浜祐子，
申请(专利权)人：旭硝子株式会社，
类型：发明
国别省市：JP