一种用于遗传转化藻类的新型启动子制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种可适用于广泛种类的藻类的、且高效的遗传转化技术。本发明专利技术涉及的启动子以具有构成非编码区域的多核苷酸等为特征，所述非编码区域位于编码与ＣｄｅｂＤＮＡ病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于遗传转化藻类的新型的启动子、含有该启动子的载体、以及使用该载体的藻类的遗传转化方法。
技术介绍
利用作为恒久的且稳定的能源的太阳光在能源对策考虑上是非常重要的。植物类的光合成是能够最有效地将太阳光能量转化为化学能量的良好的系统，不但吸收同化环境中的二氧化碳或过剩的营养盐，还释放出氧气。因此，利用植物的技术的开发作为能够解决能源问题的技术，备受期待。在植物类中，藻类由于生存在大量存在的海水和淡水中，因此，藻类的量也是相当大的，另外，藻类具有显著光合成能力。并且，在藻类中还有产生不饱和脂肪酸或抗肿瘤化合物等有用化合物的种类。另外，硅藻类中有产生有用的无机物的藻，因此，利用硅藻类的被称为生物矿化作用的技术备受关注。因此，藻类可以称得上是作为有用资源的重要的生物。通常，在产业上利用生物的情况下，可使用导入有用的基因的遗传转化技术。为了阐明基因的功能，该遗传转化技术还可用于敲除特定基因并抑制其功能的用途。到目前为止，以硅藻和绿藻为中心进行着藻类的遗传转化。但是，相关的方法是将内在性的启动子分离，使基因与其结合并导入藻类中。其中，在内在性的启动子的分离上花费大量的精力和实践，因此，并非有效的方法。另外，还存在藻类、尤其是海产藻类的遗传转化效率本身极其低的问题。另外，在藻类以外的植物或动物的遗传转化中，广泛应用的并非内在性的启动子， 而是来自病毒的启动子。例如，从十字花科植物感染的花椰菜花叶病毒(CaMV)分离的 CaMV35S启动子不仅限于十字花科植物，还可以用于广泛植物的遗传转化。另外，动物细胞的遗传转化广泛利用从细胞巨化病毒(CMV)分离的CMV启动子、从猿猴空泡病毒40(SV40) 分离的SV40启动子。与此相对，在藻类的遗传转化中，基本上还没有使用外来性的病毒启动子的例子。例如，在非专利文献1中，记载了使用CaMV35S启动子进行硅藻Cycrotela cryptica遗传转化的实验例，但是没有得到遗传转化体。另一方面，在非专利文献2中，记载了 使用CMV启动子、CaMV35S启动子以及劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子向硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)导入⑶S基因后， 所有的情况下，GUS ( β -葡萄糖苷酸酶)均得到表达。另外，在非专利文献3中，记载了使用CaMV35S启动子膝沟藻(渦鞭毛藻) Amphidinium和Symbiodinium中导入⑶S基因后，⑶S均得到表达。但是，根据其它文献 (非专利文献4)，无论多么拼命努力，其它的组均没有出现膝沟藻的遗传转化成功的报告。在先技术文献非专利文献非专利文献1 =Dunahay, T. G.等，Journal of Phycology (藻类学杂志)，vol. 31， pp.1004-1012(1995)非专利文献2 =Sakaue, K 等，Physiologia plantarum( 7 4 夕才口夕了 · 7°，> 夕，A )vol. 133，pp. 59-67(2008)非专利文献3 =Lohuis, M. R.等，The Plant Journal (植物杂志)，vol. 13， pp.427-435(1998)非专利文献4 :Walker，Τ. L.等，Journal of Phycology (藻类学杂志)，vol. 41， pp.1077-1093(2005)
技术实现思路
如上所述，虽然数量极少，但是存在使用来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子等的病毒启动子来遗传转化藻类的报告例。但是，也有得不到遗传转化体或者无再现性的报告。另外，根据本专利技术的专利技术人的见解，广泛应用于其它的植物类的遗传转化的CaMV35S启动子对藻类的适用范围极其窄。 从藻类的存在量极大，另外，存在藏有各种有用性的种类出发，作为用于遗传转化的启动子，期望能够适用于广泛种类的藻类的启动子。进一步，从通常藻类、尤其是海产藻类的遗传转化效率非常低考虑，亟待高效的遗传转化技术的开发。因此，本专利技术所要解决的课题是提供能够适用于广泛种类的藻类、且高效的遗传转化技术。本专利技术的专利技术人为了解决上述课题，进行了深入的研究。其结果发现位于被认为是编码柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)DNA病毒(CdebBNAV)的复制蛋白质的基因的上游的启动子，能够有效地遗传转化超出目的多种藻类，从而完成了本专利技术。本专利技术涉及的新型启动子，其特征在于具有下述(1)-03)中任意一种碱基序列。(1)构成非编码区域的多核苷酸，所述非编码区域位于编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游；(2)缺失、置换或添加了上述多聚核苷酸(1)的一个或多个核苷酸的多聚核苷酸， 并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸；(3)在严格的条件下与上述多聚核苷酸(1)杂交，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸。本专利技术涉及的载体的特征在于，该载体含有上述新型的启动子，以及编码任意蛋白质的基因。另外，本专利技术涉及的藻类的遗传转化方法，其特征在于，该遗传转化方法包括制备上述载体的工序，以及将上述载体导入藻类细胞的工序。附图说明图1为表示含有本专利技术涉及的启动子的质粒载体的结构的一例子的图；图2为表示含有本专利技术涉及的启动子的质粒载体的结构的一例子的图；图3为表示确认通过本专利技术的方法遗传转化的藻类细胞等中所包含的导入基因的有无的实验的结果的电泳照片；图4为表示确认通过本专利技术的方法遗传转化的藻类细胞等中所包含的导入基因的有无的实验的结果的电泳照片；图5是表示用于确定本专利技术的启动子的核心元件的实验结果的图；由该结果可知在编码与CdebDNA病毒的复制有关的蛋白质的基因的上游区域的-72到-33之间的序列中含有核心元件；图6为表示含有本专利技术的启动子的质粒载体的结构的一个例子的图；图7为表示海产藻类筒柱藻(C. fusiformis)的遗传转化实验的结果的照片；(1) 表示使用了本专利技术的启动子的情况的结果，(2)表示未使用本专利技术的启动子的情况的结果。具体实施例方式本专利技术涉及的第一启动子具有(1)构成位于编码与CdebDNA病毒的复制有关的蛋白质的基因的上游的非编码区域的多聚核苷酸。CdebDNA病毒是感染硅藻柔弱角毛藻的病毒。迄今为止，对藻类、尤其是海产藻类显示感染性的病毒的报告例很少，近年来，本专利技术的专利技术人成功地从赤潮异弯藻(，74 K )、膝沟藻、硅藻等的藻类中分离了各种病毒。本专利技术涉及的CdebDNA病毒便是本专利技术的专利技术人分离的海产藻类感染性病毒之一。编码与复制相关的蛋白质的基因，只要是与CdebDNA病毒的复制相关的基因并且积极地表达的基因，就没有特别的限定。在本专利技术中，编码区域是指经过mRNA翻译成蛋白质的部分，非编码区域是指编码区域以外的部分。即，非编码区域是指位于ATG等的起始密码子的上游的部分，除了未被 mRNA转录的部分，还包括被mRNA转录但未翻译成蛋白质的部分。通常，启动子具有转录的关键的核心元件和促进或抑制转录的调控元件，在导入基因时，特别重要的是利用核心元件。作为核心元件已知的有TATA框、启动子元件(Inr)、 下游(夕‘々> ^卜U —卜)元件等，作为调控元件已知的有CAAT框、本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种启动子，其特征在于，该启动子具有下述（１）－（３）任意一项的结构，（１）构成非编码区域的多核苷酸，所述非编码区域位于编码与ＣｄｅｂＤＮＡ病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游；（２）缺失、置换或添加了上述多聚核苷酸（１）的一个或多个核苷酸的多聚核苷酸，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸；（３）在严格的条件下与上述多聚核苷酸（１）杂交，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：足立真佐雄，
申请(专利权)人：国立大学法人高知大学，
类型：发明
国别省市：JP