本发明专利技术涉及一种番茄遗传转化的方法，属于遗传工程技术领域，具体的说公开了一种番茄种子整体侵染的方法，该方法包括测成熟番茄种子的生理吸胀曲线；含有目标基因的发根农杆菌培养；结合番茄种子的生理吸胀曲线，将消毒灭菌的番茄种子转入到OD600值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时；在25℃黑暗条件下共培养3天；抗性植株的筛选；抗性植株的生根及培育；转化植株炼苗及移栽等步骤。本发明专利技术由于采用在番茄种子吸胀阶段用发根农杆菌菌液侵染，大大提高了转化效率，经过压力筛选培养基进行筛选，缩短了实验周期2-3个月，简化了实验过程，减少了转化后的鉴定工作量。对番茄基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种农杆菌介导转化番茄的方法，属于遗传工程
，具体涉及番茄种子整体侵染转化的方法。
技术介绍
番茄是一种世界性种植的最重要的鲜食和加工原料。它的基因组较小，是一种理想的模式植物。另外，番茄还具有自花授粉易于纯合、生长周期短、在温室内可周年生长等优点，因而其遗传转化研究备受关注。自从1986年McCormick等首次用农杆菌介导的方法获得转基因番茄植株以来，番茄的遗传转化研究不断发展，但转化效率有很大差异。影响农杆菌介导番茄遗传转化的因素很多，如番茄基因型、侵染时间、分化培养基等，其中基因型对植物生长调节剂的专一性，使得需要对每个番茄基因型的转化过程分别进行研究，以寻求不同基因型植株最适合的转化方法，即由于再生受基因型限制，从而使转化变得较困难；外植体大小对番茄的再生也有重要影响，理想的外植体大小为叶片0.5cm2，外植体的放置方向有近轴面向上和背面向上两种方式，但基本原则是使外植体的伤口与培养基有较好的接触，以利于外植体愈伤组织的诱导和芽的分化；基因型、分化培养基都是基于再生体系而形成的限制，从而使番茄的遗传转化变得更困难。番茄是植物基因工程中进行遗传转化的重要模式植物之一。目前在番茄的遗传转化过程中还存在一些问题，如转化率低，转化体、转化植株后代遗传不稳定，操作复杂等。这些问题阻碍了番茄基因工程的研究。因此，建立高效的番茄遗传转化体系，为植物功能基因研究及基因工程改良提供高效的遗传转化平台，从而促进其产业化发展。农杆菌所携带的目标基因能否成功转入到植物基因组中，对后续实验有着重要影响。在常规的农杆菌介导的植物遗传转化方法中，常选用的外植体为具有分生能力的细胞、幼嫩的组织、子叶及下胚轴等，也采取预培养等使细胞处于感受态的技术，这些都有利于转化率的提高。但目前这些方法转化效率还很低、操作过程也较繁琐，实验周期较长。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的目的在于克服现有番茄遗传转化效率低、转化周期长及操作过程繁琐的难点，提供一种番茄种子整体侵染的方法，从而提高番茄的转效率。本专利技术是按以下技术方案实现的:，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，步骤包括:①测成熟番茄种子的生理吸胀曲线，②含有目标基因的发根农杆菌培养，③番茄种子消毒灭菌，④结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到0D_值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时，⑤在25°C黑暗条件下共培养3天，⑥抗性植株的筛选，⑦抗性植株的生 根及培育，⑧转化植株炼苗及移栽等步骤；其中:步骤①所述测成熟番茄种子的生理吸胀曲线的方法是:取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取I份浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；步骤②所述含有目标基因的发根农杆菌培养的方法是:将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml含有50 Ug πιΓ1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养5_8小时，然后取I ml转接于50 ml含有50 Ug.πιΓ1卡那霉素和110 umol.L—1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养12-16小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25°C、转速3500 rpm条件下离心10分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6 mg.Γ1 6-BA和110 umol.Γ1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至0D_值为0.8-1.3备用；步骤③所述番茄种子灭菌的方法是:挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，C12灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；步骤④所述结合番茄种子的生理吸胀曲线，侵染番茄种子7-9小时的方法是:结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤②制备好的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，于26°C, 166 rpm条件下振荡培养7-9小时；步骤⑤所述的共培养的方法是:待步骤④侵染7-9小时后，从摇床中取出三角瓶置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25°C黑暗条件下，共培养3天；共培养培养基是指:在MS培养基中加入6 mg -Γ1 6-BA和110 umol -Γ1乙酰丁香酮和7 g.L-1琼脂，pH值5.80-5.82 ；步骤⑥所述抗性植株的筛选其方法是:将经步骤⑤共培养的种子，转接到压力筛选培养基上培养1.5-2个月，获得抗性植株。压力筛选培养基是由1/2MS培养基中加入0.2mg.L 1 6-BA 和 I mg.L 1 IBA 和 250 mg.L 1 Cef 和 50—100 mg.L 1 Kan 组成。步骤⑦所述抗性植株的生根`及培育的方法是:将步骤⑥筛选之后成活的抗性植株接种在生根培养基上进行生根及培育，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12 day /8 night的人工气候箱中培养20-30天，生根培养基是由1/2MS培养基加入0.4 g-Γ1活性炭组成。步骤⑧所述转化植株炼苗及移栽的方法是:当步骤⑦获得的植株根长达到8cm左右时，置于温室内开盖2-3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室培养。上述方法中使用的LB和MS培养基为常规培养基:LB液体培养基组成为10 g-Γ1 NaCl, 10 g.L—1蛋白胨和5 g.L—1酵母浸膏，pH值7.0 ；LB固体培养基是指在LB液体培养基中，再添加15 g.L—1琼脂；MS 培养基组成为:ΚΝ03 1 900 mg. Λ NH4NO3 1650 mg. Λ CaCl2.2H20 440 mg. ΛMgSO4.7H20 370 mg. Λ KH2PO4 170 mg. Λ H3BO3 6.2 mg. Λ MnSO4.H2O 16.9 mg. ΛZnSO4.7Η20 8.6 mg.L-1，KCl 0.83 mg. Λ Na2MoO4.2H20 0.25 mg.Γ1，CuSO4.5H20 0.025mg.ΙΛ CoCl2.6H20 0.025 mg. Λ Na2EDTA 37.3 mg. Λ FeSO4.7H20 27.8 mg.L'肌醇20 g*L-1,烟酸100 mg.I71,盐酸批卩多醇100 mg.171,盐酸硫胺素100 mg.171,甘氨酸 400 mg.L-1,鹿糖 30 g.L—1, pH 值 5.80-5.83。上述方法中各步骤使用的培养基均用蒸馏水按常规方法配制。上述番茄种子整体侵染的方法中:步骤②所述农杆菌菌株是含有Gt基因的发根农杆菌(Ageobacterium rhizogenes)A4菌株，该菌株已在ZL200710055462.3公开并使用。在番茄种子整体侵染的方法中，该菌株用于侵染的菌液浓度0D_为0.8-1.3，其中优选1.0。步骤④所述的番茄种子吸胀的时间段为0-7/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种番茄遗传转化的方法，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，步骤包括：①?测成熟番茄种子的生理吸胀曲线，②?含有目标基因的发根农杆菌培养，③?番茄种子的消毒灭菌，④?结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD600值为0.8?1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7?9小时，⑤?在25℃黑暗条件下共培养3天，⑥?抗性植株的筛选，⑦?抗性植株的生根及培育，⑧?转化植株炼苗及移栽。
【技术特征摘要】
1.一种番茄遗传转化的方法，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，步骤包括:①测成熟番茄种子的生理吸胀曲线，②含有目标基因的发根农杆菌培养，③番茄种子的消毒灭菌，④结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到0D_值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时，⑤在25°C黑暗条件下共培养3天，⑥抗性植株的筛选，⑦抗性植株的生根及培育，⑧转化植株炼苗及移栽。2.根据权利要求1所述的一种番爺遗传转化的方法，其特征在于:步骤①所述测成熟番茄种子的生理吸胀曲线的方法是:取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取I份浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；步骤②所述含有目标基因的发根农杆菌培养的方法是:将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活化2次，挑取该菌株的单菌落接种到5 ml含有50 Ug πιΓ1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26 °C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养5_8小时，然后取I ml转接于50 ml含有50 Ug.πιΓ1卡那霉素和110 umol.L—1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26 °C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养12-16小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25 °C、转速3500 rpm条件下离心10分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6 mg.Γ1 6-BA和110 umol -T1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至0D_值为0.8-1.3备用；步骤③所述番茄种子灭菌的方法是:挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，Cl2灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；步骤④所述结合番茄种子的生理吸胀曲线，侵染番茄种子7-9小时的方法是:结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤②制备的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐洪伟，周晓馥，吕杰，
申请(专利权)人：吉林师范大学，
类型：发明
国别省市：
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