一种南非半边莲遗传转化方法，包括以下步骤，(1)外植体的制备；(2)质粒载体构建；(3)通过电击将双元质粒载体导入农杆菌的方法；(4)半边莲的遗传转化。本发明专利技术转化效率高、方法完整，可用作南非半边莲遗传转化的标准方法。本发明专利技术对南非半边莲的转基因育种有重要意义，也为南非半边莲用于基因功能验证提供技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种植物遗传转化方法，具体设及。 技术背景 南非半边莲(Xobeliaerinus)属于菊目（Asterale)枯梗科（Campanulaceae)植 物，南非半边莲又叫山梗菜、六倍利，多年生草本植物，原产地南非。由于南非半边莲具有植 株矮小、生长期短、开花量大、花色丰富等特点，常用作园林绿化的饰边植物和组合盆栽；同 时，也是研究花色分子遗传的理想模式植物。当前，南非半边莲作为重要的花弁作物，虽然 由于其优良特性可作为花弁的模式植物，但目前还没有成熟和系统的转化方法被报道。 目前，植物遗传转化技术在实现手段上主要有农杆菌转化和基因枪两种手段。其 中，基因枪法属于直接转化的方法，是直接将裸露的DNA向植物组织转移，因而DNA在植物 基因组中的整合缺乏限制因素，随机性大，规律性差；同时，由于转基因当代情况复杂，后代 的基因分离情况也就复杂，分析较为困难。而农杆菌转化系统与DNA直接转化方法中DNA 被动地整合到染色体上不同，它是一种生物转化系统，因而具有主动性，它选择性地转移Ti 质粒上W两个25bp重复序列为两端的T-DNA;在virD2蛋白的帮助下，它可W主动地插入 到植物染色体上；并且，通过农杆菌转化系统获得的转基因植株还具有基因拷贝数低（一 般1~3拷贝）、转基因较少沉默W及可转移基因片段较长等优点。植物的再生往往从愈伤 组织或外植体的特定区域发起，形态发生途径有两条：一条是器官发生，即由愈伤组织形成 芽或根的过程；另一条是体细胞胚发生，其标志是形成在类似合子胚结构的胚状体，它在一 定条件下可W长成完整的植株。其中，体细胞胚的形成，可W通过两种途径：一是通过外植 体组织单一细胞直接进行体细胞胚形成，可W保持品种的稳定性；二是通过外植体形成愈 伤组织间接进行体细胞胚形成。愈伤组织系统经历了脱分化及再分化过程，有如下优势：第 一，已分化的细胞均回到脱分化的分生细胞水平，易接受外源基因，转化效率较高；第二，扩 繁量大，转化的愈伤组织通过继代培养，能够分化更多转化植株；第=，多种组织、器官均能 诱导愈伤组织，外植体试材广泛。但是，愈伤组织再生途径的缺点是嵌合体较多，获得的再 生植株无性系变异较多，转化的外源基因遗传稳定性较差，运是由于外植体诱导的愈伤组 织为多细胞形成。因此，由外植体直接分化芽比诱导愈伤组织困难，使转化细胞直接分化成 植株更为困难，其转化频率低于愈伤组织再生系统；而体细胞胚具有很强的接受外源DNA 的能力，转化率和转化效率都很高。 综上，探索寻找一种通过农杆菌介导南非半边莲外植体体细胞胚的高效遗传转化 方法，对南非半边莲的转基因育种有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供。 本专利技术解决其技术问题采用的技术方案，，包括W 下步骤： (I)外植体的制备：首先培养无菌苗，获取幼苗真叶作外植体； (2)质粒载体构建：质粒载体PIG121血（优选含有百合化F3H基因的启动子的 PIG121血载体）通过大肠杆菌进行扩增，提取、纯化质粒DNA后用DNA限制性内切酶酶切， 再通过琼脂糖凝胶电泳的方法进行纯化，备用；通过PCR对目标基因进行扩增，设计的引物 含有相应的位点，用T4连接酶将制备的目标基因DNA与空载体进行定向连接。 (3)农杆菌电击转化：将质粒载体通过电击导入浓度为ODe。。= 0. 6~1. 0感受态 农杆菌细胞EHA105中，加入LB培养基，室溫静置50~70min，将菌液涂布到含50mg/L卡那 霉素和潮霉素的LB平板上，在28°C下培养2~3d，通过PCR方法筛选阳性克隆，接着放大 和保存阳性EHA105细胞，然后挑取成功转化双元质粒载体的农杆菌EHA105,接种于含卡那 霉素50mg/L和潮霉素50mg/L的YEB液体培养基中，摇床25~28°C，转速150~200spm， 培养18~24h;接着挑取过夜培养物于含50mg/l卡那霉素和潮霉素的Y邸培养基中，摇床 25~28°C，转速150~200spm，培养18~2地，获得菌液浓度为0D600 = 0. 6~1. 0 ;挑取 细胞于Y邸培养基中，培养6~12h，将菌液在3000~6000巧m条件下离屯、5~15min，用 细菌悬浮液培养基重新悬浮农杆菌，使得菌液浓度为0D600 = 0. 2用于转化； (4)半边莲的遗传转化：将真叶剪成5mmX5mm叶片，浸泡在EHA105农杆菌悬浮液 中培养3~5min，将浸泡后的叶片外植体转移到共培养培养基上，在24~26°C下黑暗培养 2. 5~3. 5山用清洗培养基清洗叶片2~4次；接着将叶片外植体转接到去农杆菌介导培养 基上，在24~26°C，光照条件下培养1周；接着将叶丝转移到筛选培养基（SM)，24~26°C 下光照培养，每2周继一次代，持续1个月；接着在选择/再生培养基上培养愈伤组织，24~ 26°C光照培养1个月；然后转接幼苗到生根培养基上，在24~26°C光照培养16h，培养6~ 8天，直到长出完整的转化植株时炼苗移植。 进一步，步骤（1)中，所述培养无菌苗是将种子浸泡于70%乙醇5~10s，接着转 入1 %的次氯酸钢溶液中浸泡20min，然后用无菌水冲洗种子3次，将种子接种于含0. 3%无 薦糖的植物凝胶的1/2MS培养基上，在25°C，光照时数为16h的条件下，培养1~2周后取 叶片作外植体。 进一步，步骤（2)中，PIG121血空载体与目标基因DNA混匀后，在65°C下先处理 Smin，迅速置于冰上冷却，之后再进行连接。 阳01引进一步，步骤（4)中，所述IL共培养培养基（CCM)成分为：100mlIOXMS大量+IOml100XMS微量巧ml200XMS铁盐+1.25ml800XMS有机+30g薦糖+IOOmg肌醇+Sg 琼脂+Img2, 4-D+0.ImgKinetin+p册.2+19. 6mg乙酷下香酬； 所述IL清洗培养基（WL)成分：100mlIOXMS大量+IOmlIOOXMS微量巧ml 200X铁盐+P册.6+300mgaugmentin，用此培养基清洗农杆菌浸染后的叶片，能有效除去活 体农杆菌及其它杂物； 所述IL去农杆菌培养基（AEM)成分：100mlIOXMS大量+IOmlIOOXMS微量 +5ml200X铁盐+1.25ml800XMS有机+30g薦糖+100g肌醇+Sg琼脂+Img2, 4-D+0.Img kinetin+p册.7-5. 8+300mgAu卵entin，其中高浓度的lOOg/L肌醇对愈伤组织分化和胚状 体的形成有促进作用，用此培养基能有效杀死农杆菌，并诱导愈伤或体细胞胚的产生； 所述IL筛选培养基（SM)成分：100mlIOXMS大量+IOmlIOOXMS微量巧ml 200X铁盐 +1. 25ml800XMS有机 +30g薦糖+100g肌醇+Sg琼脂+Img2, 4-D+0.Img Kinetin+p册.7-5. 8+300mgAugmentin+30mghygromycin，用此培养基能有效筛选出抗性 愈伤或体细胞胚； 所述IL选择/再生培养基（SRM)成分：100mlIOXMS大量+IOmlIOOXMS微量 +5ml200X铁盐+1.25ml800XMS有机+30g薦糖+10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种南非半边莲遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体的制备：首先培养无菌苗，获取幼苗真叶作外植体；(2)质粒载体构建：质粒载体pIG121Hm通过大肠杆菌进行扩增，提取、纯化质粒DNA后用DNA限制性内切酶酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳的方法进行纯化，备用；通过PCR对目标基因进行扩增，设计的引物含有相应的位点，用T4连接酶将制备的目标基因DNA与空载体进行定向连接。(3)农杆菌电击转化：将质粒载体通过电击导入浓度为OD600＝0.6～1.0感受态农杆菌细胞EHA105中，加入LB培养基，室温静置50～70min，将菌液涂布到含50mg/L卡那霉素和潮霉素的LB平板上，在28℃下培养2～3d，通过PCR方法筛选阳性克隆，接着放大和保存阳性EHA105细胞，然后挑取成功转化双元质粒载体的农杆菌EHA105，接种于含卡那霉素50mg/L和潮霉素50mg/L的YEB液体培养基中，摇床25～28℃，转速150～200spm，培养18～24h；接着挑取过夜培养物于含50mg/l卡那霉素和潮霉素的YEB培养基中，摇床25～28℃，转速150～200spm，培养18～24h，获得菌液浓度为OD600＝0.6～1.0；挑取细胞于YEB培养基中，培养6～12h，将菌液在3000～6000rpm条件下离心5～15min，用细菌悬浮液培养基重新悬浮农杆菌，使得菌液浓度为OD600＝0.2用于转化；(4)半边莲的遗传转化：将真叶剪成5mm×5mm叶片，浸泡在EHA105农杆菌悬浮液中培养3～5min，将浸泡后的叶片外植体转移到共培养培养基上，在24～26℃下黑暗培养2.5～3.5d，用清洗培养基清洗叶片2～4次；接着将叶片外植体转接到去农杆菌介导培养基上，在24～26℃，光照条件下培养1周；接着将叶丝转移到筛选培养基(SM)，24～26℃下光照培养，每2周继一次代，持续1个月；接着在选择/再生培养基上培养愈伤组织，24～26℃光照培养1个月；然后转接幼苗到生根培养基上，在24～26℃光照培养16h，培养6～8天，直到长出完整的转化植株时炼苗移植。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赖云松，李焕秀，唐茜，赵媛媛，李莎，唐懿，汪志辉，王小蓉，马啸，王迅，张锐静，宿李宏，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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