本发明专利技术公开了一种用于杏鲍菇遗传转化的重组质粒及其应用。本发明专利技术提供了一种DNA片段，自上游至下游依次包括序列1所示启动子和序列2所示终止子。本发明专利技术还提供了含有所述DNA片段的重组质粒。本发明专利技术所建立的杏鲍菇遗传转化方法，为杏鲍菇生长发育机理的基础研究和分子育种奠定了理论基础和技术支持，为新型生物反应器的研发提供储备，为杏鲍菇资源及其生物活性物质的开发利用开辟了广阔的应用领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于杏鲍菇遗传转化的重组质粒及其应用。
技术介绍
杏鲍菇(Pleurotus eryngii)又名刺芹侧耳，隶属于担子菌亚门(Basidio mycotina),层菌纲(Hymenomycetes),无隔担子菌亚纲(Homobasidiomycetidae),伞菌目 (Agaricales)，侧耳科(Pleurotaceae)，侧耳属(Pleurotus)。杏鲍菇是近年来开发栽培成功、适于工厂化栽培的珍稀食用菌新品种，其风味独特、营养丰富，能够产生多种生物活性分子和酶，且其多糖具有较好的降血糖、增强肌体免疫功能、抗肿瘤和抗氧化活性，因此杏鲍菇具有很高的食用、药用、经济和生态价值，市场前景广阔。杏鲍菇在北京市场上已经占食用菌总产量的5. 01 %。杏鲍菇生长周期较长、生物转化率较低，限制了杏鲍菇及其生物活性物质的开发应用，因此基于杏鲍菇遗传发育机理的基础研究亟待加强。高效的食用菌遗传转化体系的建立是从事分子生物学和遗传学研究的基础。杏鲍菇高效遗传转化体系的建立，将为其遗传发育机理的研究奠定基础，为其分子育种提供技术支持，为新型生物反应器的研发提供储备，为杏鲍菇及其生物活性物质的开发利用提供前提条件，具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于杏鲍菇遗传转化的重组质粒及其应用。本专利技术提供了一种DNA片段，自上游至下游依次包括启动子和终止子(杏鲍菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子)；所述启动子的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述终止子的核苷酸序列如序列表的序列2所示。所述DNA片段还包括抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列3 自5’末端第763-1793位核苷酸所示的hph基因。所述DNA片段可用于制备转基因杏鲍菇。含有所述DNA片段的重组质粒也属于本专利技术的保护范围。所述重组质粒(重组质粒甲)具体可为在PUC19质粒的多克隆位点间自上游至下游依次插入所述启动子和所述终止子得到的重组质粒。所述重组质粒优选为将PUC19质粒 Sph I和Ml I酶切识别序列之间的小片段取代为所述启动子，BamH I和Mc I酶切识别序列之间的小片段取代为所述终止子得到的重组质粒。所述重组质粒(重组质粒乙)具体还可为在以上所述重组质粒(重组质粒甲)的所述启动子和所述终止子之间插入含有外源基因的DNA片段得到的重组质粒。所述含有外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示的hph基因。所述外源基因具体可为序列表的序列3自5’末端第1-7 位核苷酸所示的egfp基因。所述含有外源基因的DNA片段具体可为序列表的序列3所示的DNA片段。 所述重组质粒可用于制备转基因杏鲍菇。用所述重组质粒制备转基因杏鲍菇的方法可为将所述重组质粒(重组质粒乙) 转化杏鲍菇的原生质体，培育后得到转基因杏鲍菇。所述转化具体可通过PEG/CaCl2介导实现。用所述重组质粒制备转基因杏鲍菇的方法可包括如下步骤(1)用溶壁酶裂解平菇菌丝，得到原生质体；(2)将所述重组质粒导入所述原生质体，培养后得到转基因平菇。所述步骤(1)具体可为将平菇菌丝悬浮于1.5g/100mL的溶壁酶溶液，32°C、 60rpm温浴30小时，过滤并收集滤液，然后将所述滤液3000rpm离心IOmin并收集沉淀，然后将所述沉淀洗涤后悬浮于MMC缓冲液中，即为原生质体溶液。MMC缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为50mM马来酸缓冲液(pH 5. 5)；所述溶质及其在MMC缓冲液中的浓度如下0. 5M甘露醇、5mM CaCl20所述步骤( 可为将步骤(1)的原生质体和所述重组质粒在PTC缓冲液中混合均勻，依次进行冰浴和室温静置，离心收集沉淀。所述步骤⑵具体可为将70μ 1步骤⑴得到的原生质体溶液和20 μ g重组质粒 (具体可为10 μ 1 2yg μ Γ1的重组质粒溶液)震荡混勻，然后加入50 μ 1 PTC缓冲液并震荡混勻(Is X 6次)，然后冰浴25min，然后加入Iml PTC缓冲液后室温静置20min，3000rpm 离心lOmin，收集沉淀。PTC缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为IOmM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)；所述溶质及其在PTC缓冲液中的浓度如下0. 4g/mL PEG3350、100mM CaCl20所述培养可包括再生培养和选择性培养。所述再生培养可为先用液体再生培养基25°C静置培养M小时，然后倾注于固体再生平板(含100yg/ml潮霉素)25°C培养10-14天。所述选择性培养可为将再生培养中的单菌落转接于固体MCM平板(含100 μ g/ml 潮霉素)上25°C培养10-14天；采用相同的方法连续转接3-5代，获得纯培养的菌株。液体MCM培养基的制备方法将酵母提取物2g、胰蛋白胨2g、葡萄糖20g、硫酸镁 0. 5g、磷酸二氢钾0. 5g和磷酸氢二钾Ig溶于水并用水定容至1L。液体再生培养基的制备方法在液体MCM培养基中添加山梨醇，使其终浓度为1M。固体MCM平板在液体MCM培养基中添加琼脂，使其浓度为20g/L。固体再生平板的制备方法在液体再生培养基中添加琼脂，使其浓度为20g/L。本专利技术还保护序列表的序列1所示的启动子。所述启动子可以用于启动目的基因表达。所述目的基因可为序列表的序列3自5’末端第1-7 位核苷酸所示的egfp基因。 所述目的基因也可为所述egfp基因和hph基因的融合基因。所述hph基因如序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示。所述融合基因具体可为序列表的序列3所示的 DNA片段。所述启动子具体可在杏鲍菇中启动所述目的基因表达。本专利技术还保护序列表的序列2所示的终止子。本方法的转化效率可以达到119-155个转化子/ μ g DNA,并具有较好的传代稳定性。本专利技术所建立的杏鲍菇遗传转化方法，为杏鲍菇生长发育机理的基础研究和分子育种奠定了理论基础和技术支持，为新型生物反应器的研发提供储备，为杏鲍菇资源及其生物活性物质的开发利用开辟了广阔的应用领域。 附图说明图1为pUC19质粒的结构示意图。图2为pEGFP-Cl质粒的结构示意图。图3为重组质粒pUEGFP-hph的结构示意图。图4为阳性转化子的PCR鉴定；M=Ikb plus DNA ladder ；P 质粒pEGFP-Cl (阳性对照)；1-4:阳性转化子。图5为阳性转化子的RT-PCR鉴定；M =Ikb plus DNA ladder ； 1-4 阳性转化子。图6为荧光显微镜下观察阳性转化子的绿色荧光蛋白的表达情况；A 在放大400 倍明视野下的图像；B 在放大400倍，蓝光激发状态下的图像。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。pUC19质粒购自宝生物工程(大连)有限公司；产品目录号D3219。pAN7_l质粒购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；产品目录号Bi0Vect0r829。pEGFP-Cl质粒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；产品目录号MCV046。杏鲍本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许峰，刘宇，尹永刚，王守现，赵爽，王鹏，耿小丽，王兰青，孟莉莉，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。