一种杉木遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种杉木遗传转化方法，包括：转化受体的建立，农杆菌菌液制备，侵染，脱菌培养和筛选培养。该杉木遗传转化方法，以杉木悬浮细胞系为受体，以GUS基因为报告基因通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，通过体细胞胚胎发生方式实现植株再生，建立起稳定高效的杉木遗传转化体系。利用本技术体系，可以以较低成本对杉木进行遗传改良，将基础理论研究中获得的抗病、抗逆、木材形成等相关的基因进行遗传转化，获得具有速生、抗病、抗逆性强等特点的优质杉木品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及杉木遗传转化方法，具体涉及一种以杉木悬浮细胞系为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。
技术介绍
杉木是我国特有的用材树种，是南方各省区最重要的造林树种之一。杉木生长快，产量高，性材好，用途多，木材销路好，其木材是优质的建筑材，装饰用材，是我国最重要的商品材树种。选育出生长速度快、繁殖力高、抗逆性强的杉木优株和无性系对林业生产具有十分重要的意义。然而针叶树生长周期长、树体高大，而且由于长期异交，具有高度的杂合性和大量的遗传负荷。因此传统育种周期长，难以适应速生树木遗传改良的需要。林木遗传基因工程是林木生物技术的前沿领域，它不仅为林木遗传改良中的种质创新开辟了一条新的途径，同时也是研究基因功能的重要手段。将基因工程与常规育种技术相结合，可大大缩短林木育种周期，加速育种进程。林木基因工程是通过适合的基因转移技术，导入有用的外源基因，获得转基因植株，进行林木遗传改良或有关的研究。近年来，林木基因工程取得了较大的进展。目前，已有几百种植物得到遗传改良，在丰产，抗病，抗寒等领域广泛应用。但在针叶树中却由于缺乏良好的转化方法和再生系统而受到严重限制。长期以来，人们认为根癌农杆菌的宿主主要为双子叶`植物，但自从D.Cleene和D.Ley首次报道根癌农杆菌菌株B6也能感染裸子植物受伤组织，并产生冠瘿瘤后，许多学者开始利用根癌农杆菌进行裸子植物尤其是针叶树的基因转化的研究。并且已经证明外源基因在部分针叶树如白云杉、挪威云杉、火炬松及北美黄杉等的细胞组织中得到表达。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供，以杉木悬浮细胞系为受体，进行农杆菌介导的遗传转化，以建立稳定高效的杉木遗传转化体系。技术方案:为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下: ，包括以下步骤: (1)转化受体的建立: 取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞，接种到杉木液体培养基中，23°C，85r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，第三次继代后3天后即可用于农杆菌侵染；其中，杉木液体培养基为 DCR 基本培养基，附加 Vc 10 mg/L, GA 0.1-2 mg/L, ΑΒΑ 2-5 mg/L, CH 0.5g/L，麦芽糖 30 g/L； (2)农杆菌菌液制备:活化EHA105菌液，挑取单菌落，再次活化，28°C、220r/min振荡培液体养至OD6tltl为0.6-0.8，用杉木液体继代培养基重悬菌体； (3)侵染: 将菌液摇匀，取3mL菌液加到继代3天的杉木悬浮细胞中，静置l_3min后，置于23°C，85r/min的恒温摇床继续振荡培养16 36h ； (4)脱菌培养: 用无菌水数次洗菌，用杉木液体培养基重悬杉木愈伤，将重悬后的杉木愈伤以铺平板的方式转移到加有头孢霉素500mg/L的体胚诱导培养基上，其中每皿4-5mL ;并放入23°C恒温培养箱中暗培养。每隔21天继代一次，诱导3(Γ60天；体胚诱导培养基为1/2DCR基本培养基，附加 Vc 10 mg/L, GA 2-8 mg/L，肌醇 5 g/L, CH 0.5 g/L, A C2 g/L，麦芽糖 25 g/L,水晶洋菜2.8 g/L ； (5)筛选培养: 待杉木子叶胚成熟后，将其挑到加有200 mg/L头孢霉素的DCR基本培养基上，23°C光照培养。培养21天后，转移到加有100 mg/L头孢霉素，20 mg/L卡那霉素的DCR基本培养基上进行筛选培养；每21天继代一次。步骤(2)中，杉木液体继代培养基重悬菌体，菌液的0D_为0.5。步骤(4)中，无菌水中含有500mg/L头孢霉素。 所述的EHA105带有35S KUS基因和NPT-1I基因。步骤(5 )中，继代2次后，就可用于移栽。有益效果:与现有技术相比，本专利技术的杉木遗传转化方法，以杉木悬浮细胞系为受体，以GUS基因为报告基因通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，通过体细胞胚胎发生方式实现植株再生，建立起稳定高效的杉木遗传转化体系。利用本技术体系，可以以较低成本对杉木进行遗传改良，将基础理论研究中获得的抗病、抗逆、木材形成等相关的基因进行遗传转化，获得具有速生、抗病、抗逆性强等特点的优质杉木品种。附图说明图1是杉木胚性愈伤显微照片 图2是杉木成熟子叶胚 图3是杉木⑶S瞬间表达检测图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。以下实施例中，所使用到的培养基配方如下，未特别列出的，为常规培养基。以下实施例中，使用的DCR (Gupta and Durzan medium)基本培养基的构成和标准配方为:340 mg/L KNO3, 556 mg/L Ca (NO3) 2.4Η20，400 mg/L NH4NO3,170 mg/L KH2PO4,85mg/L CaCl2.2H20，370 mg/L MgSO4*7H20, 37.3 mg/L Na2_EDTA.H20，27.9 mg/L FeS04.7H20，6.2 mg/L H3BO3,22.3 mg/L MnSO4*4H20,8.6 mg/L ZnS04*7H20,0.25 mg/L Na2MoO4*2H20,0.25mg/L CuS04*5H20, 0.83 mg/L KI, 0.025 mg/L CoCl2,200 mg/L MyO-1nositol, 2.0 mg/LGlycine,1.0 mg/L Thiamine1HCl,0.5 mg/L Nictinic*acid,0.5 mg/L Pyridoxine*HCl。LB 培养基配方:5 g/L Yeast extract, 10 g/L Tryptone, 5 g/L NaCl。实施例1转化受体的建立。(I)取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞约5mL，将其接种到250mL的无菌三角瓶中，并在瓶壁轻轻敲散，目的是使细胞分散。杉木胚性愈伤组织细胞的显微照片如图1所/Jn ο(2)量取50mL杉木液体培养基加入三角瓶中，将材料置于23°C，85r/min的恒温摇床振荡培养。杉木液体培养基为DCR基本培养基，附加10mg/L VC, 0.1 2.0mg/L GA，2 5mg/L ΑΒΑ, 0.5g/L CH，30g/L 麦芽糖。(3)每7天继代一次，第三次继代后3天后(即从第4代的第三天开始)即可用于农杆菌侵染。植物基因转化过程中的受体系统是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，建立的能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。目前为止，对植物基因转化受体系统的研究已经进行了大量的工作，先后建立了多种有效的受体系统，适应于不同转化方法的要求和不同的转化目的。现已建立的受体系统包括愈伤组织再生系统、直接分化再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统、生殖细胞再生系统。目前，以植物体胚发生体系或体胚作为受体系统越来越受到重视。该系统主要有以下特点:其一、组成胚状体的胚性细胞接受外源DNA能力很强，是理想的基因转化感受态细胞，而且这些细胞繁殖量大，同步性好，因此转化率很高；其二、胚状体个体间遗传背景一致，无性系变异小，成苗快，数量多，而且还可以制成人工种子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杉木遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）转化受体的建立：取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞，接种到杉木液体培养基中，23℃，85r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，第三次继代后3天后即可用于农杆菌侵染；其中，杉木液体培养基为DCR基本培养基，附加10?mg/L?Vc，0.1?2.0?mg/L?GA，2?5mg/L?ABA，0.5g/L?CH，30g/L麦芽糖；（2）农杆菌菌液制备：活化EHA105菌液，挑取单菌落，再次活化，28℃、220r/min振荡培液体养至OD600为0.6?0.8，用杉木液体继代培养基重悬菌体；（3）侵染：将菌液摇匀，取3mL菌液加到继代3天的杉木悬浮细胞中，静置1?3min后，置于23℃，85r/min的恒温摇床继续振荡培养16~36h；（4）脱菌培养：用无菌水数次洗菌，用杉木液体培养基重悬杉木愈伤，将重悬后的杉木愈伤以铺平板的方式转移到加有头孢霉素500mg/L的体胚诱导培养基上，其中每皿4?5mL；并放入23℃恒温培养箱暗培养；每隔21天继代一次，诱导30~60天；体胚诱导培养基为1/2DCR基本培养基，附加Vc?10?mg/L，GA?2?8?mg/L，肌醇2?10g/L，CH?0.5g/L，AC?2g/L，麦芽糖25g/L，水晶洋菜2.8g/L；（5）筛选培养：待杉木子叶胚成熟后，将其挑到DCR基本培养基上，在23℃下进行光照培养，培养基中加有200mg/L头孢霉素；21天后转移到加有100mg/L头孢霉素，20mg/L卡那霉素的DCR基本培养基上进行筛选培养，每21天继代一次。...

【技术特征摘要】
1.一种杉木遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)转化受体的建立: 取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞，接种到杉木液体培养基中，23°C，85r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，第三次继代后3天后即可用于农杆菌侵染；其中，杉木液体培养基为 DCR 基本培养基，附加 10 mg/L Vc, 0.1-2.0 mg/L GA, 2-5mg/L ΑΒΑ, 0.5g/LCH, 30g/L麦芽糖； (2)农杆菌菌液制备: 活化EHA105菌液，挑取单菌落，再次活化，28°C、220r/min振荡培液体养至OD6tltl为0.6-0.8，用杉木液体继代培养基重悬菌体； (3)侵染: 将菌液摇匀，取3mL菌液加到继代3天的杉木悬浮细胞中，静置l_3min后，置于23°C，85r/min的恒温摇床继续振荡培养16 36h ； (4)脱菌培养: 用无菌水数次洗菌，用杉木液体培养基重悬杉木愈伤，将重悬后的杉木愈伤以铺平板的方式转移到加有头孢霉素500mg/L的体胚诱导培养基上，其中每皿4-5mL ;并放入2...

【专利技术属性】
技术研发人员：施季森，王丹，陈金慧，周小红，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：