一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，包括：杂交鹅掌楸转化受体的建立、农杆菌制备、侵染、脱菌培养和筛选培养。本发明专利技术以杂交鹅掌楸悬浮培养的单细胞作为遗传转化受体系统，通过农杆菌介导的方法，以GUS基因为报告基因，通过细胞学方法检测GUS基因的瞬间表达、长期表达、通过分子生物学方法检测等确定外源基因的高效转化。本发明专利技术采用杂交鹅掌楸单细胞起源的体细胞胚胎发生体系，有利于外源基因的导入，并降低了嵌合体的产生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及杂交鹅掌楸遗传转化方法，具体涉及。
技术介绍
杂交鹅掌楸又名鹅掌楸(马褂木)，它是由南京林业大学叶培忠教授等首次通过人工杂交的方法，将分布在亚洲的中国杂交鹅掌楸与分布在北美洲的北美杂交鹅掌楸采用人工控制授粉方法育成的杂交树种。杂交鹅掌楸叶形奇特，花色艳丽，是优良的庭院栽培和园林观赏树种。同时，其树体高大，主干圆满通直，木材结构细致均匀，色浅，易干燥，易加工，纤维较长，是优良的制浆造纸、人造板及家具用材树种，社会需求量极大。但是杂交鹅掌楸生长周期长，应用常规手段育种具有较大的困难。因此必须依靠现代生物技术并与常规育种相结合，进而缩短育种周期，加速育种进程，营造优质人工林，缓解木材供需矛盾。基因工程是生物技术的核心，为林木遗传改良开辟了一条新的途径。林木基因工程是通过适合的基因转移技术，导入有用的外源基因，获得转基因植株，进行林木遗传改良或有关的研究。近年来，林木基因工程取得了较大的进展。目前，已有几百种植物得到遗传改良，在丰产，抗病，抗寒等领域广泛应用。农杆菌介导的遗传转化是外源DNA进入植物细胞最成功和应用最为广泛的方法，自1976年D.Cleene和D.Ley (1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）杂交鹅掌楸转化受体的建立：取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞，接入含有杂交鹅掌楸M13液体培养基的三角瓶中，23℃，95r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，继代3次后建立出悬浮细胞系，即为杂交鹅掌楸转化受体；（2）农杆菌制备：先活化EHA105单菌落，在含有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L的LB液体培养基中，28℃，280r/min振荡培养至OD600为0.6?0.8，4℃离心收集菌体，用杂交鹅掌楸M13液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右；（3）侵染：取3ml菌液加到杂交鹅掌楸转化受体中，并加入乙...

【技术特征摘要】
1.一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)杂交鹅掌楸转化受体的建立:取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞，接入含有杂交鹅掌楸M13液体培养基的三角瓶中，23°C，95r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，继代3次后建立出悬浮细胞系，即为杂交鹅掌楸转化受体； (2)农杆菌制备:先活化EHA105单菌落，在含有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L的LB液体培养基中，28°C，280r/min振荡培养至0D_为0.6-0.8，4°C离心收集菌体，用杂交鹅掌楸M13液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右； (3)侵染:取3ml菌液加到杂交鹅掌楸转化受体中，并加入乙酰丁香酮lOOymol/L； 静置l_3min后，置于23°C、95r/min的恒温摇床中，继续振荡培养16 40h ； (4)脱菌培养:将杂交鹅掌楸悬浮细胞经400目及150目的筛子过筛，用Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目 的筛子上的单细胞悬浮，置于23°C、95r/min的恒温摇床，振荡培养36h后，再用400目的筛子过筛一次，并用加有头孢霉素500mg/L的Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目筛子上的单细胞收集；并将单细胞以2mL每皿的浓度铺平板，培养基加头孢霉素500mg/L，约21天继代一次；继代一次后，可以观察到子叶胚； (5)筛选培养:待子叶胚成熟，长到2cm左右，将其挑出，转到MS基本培养基上生长，其中加有头孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。2.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于:步骤(I)中，取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞5mL，将其接种到250mL的三角瓶中，并在瓶壁轻轻敲...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金慧，王丹，施季森，成铁龙，王鹏凯，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：