本发明专利技术公开了一种CdSe/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法，所述的量子点材料为CdSe/ZnS量子点，尺寸为30nm以内，表面电荷性质为正电荷。该植物细胞的量子点材料在以纳米基因载体建立高效的植物细胞转基因体系中的应用。本发明专利技术以CdSe/ZnS量子点与杂交鹅掌楸的胚性悬浮细胞采用不同的条件进行共孵育，结果表明胞吞进入完整细胞内部的表面携带正电荷的CdSe/ZnS纳米颗粒的量明显与共培养时间、温度有明显的依赖关系，它们可以通过细胞的液相胞吞作用进入杂交鹅掌楸细胞内，且不影响细胞的活性；因此以表面携带正电荷的CdSe/ZnS量子点纳米材料作为基因载体，在植物悬浮细胞的转基因研究和应用中具有广泛的前景，能够为植物基因工程提供新型的无机纳米基因载体和转基因技术体系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米技术在植物转基因领域中的应用技术，具体涉及一种Cdk/ZnS 量子点与植物细胞的共孵育方法。
技术介绍
量子点(quantum dots，QDS)作为半导体荧光纳米颗粒，具有荧光发射波长可调、 激发光谱宽而连续、荧光量子产率高等特点，且可经受多次激发，实现一元激发多元发射； 尤其荧光性质稳定，在某些情况下其发光时间是有机染料分子的100倍。凭借这些独特优势，量子点探针技术在生命科学领域中，越来越受到人们的青睐。尽管在医学和动物实验上应用已比较成熟，但其在植物细胞中的应用还处于起始阶段，主要集中在(1)对植物细胞进行动态标记，追踪其动力学过程；(2)对靶分子进行标记，研究其在细胞内生物功能的实现情况；(3)充当非病毒纳米基因载体，建立高效的植物细胞转基因体系；(4)同时作为质粒DNA的生物标记，对植物转基因过程进行跟踪和机理揭示。对于上述这些应用，都需要通过对量子点纳米颗粒和植物细胞相互作用机制的了解来实现。所以研究它们的相互作用的细胞生物学特征，并实现其过程的有效调控，逐渐成为人们研究的热点。相对于动物细胞， 植物细胞具有致密细胞壁，使纳米颗粒导入细胞内的难度增加。为避开细胞壁的阻碍，人们常通过分离的植物细胞的原生质体为生物材料，研究其和纳米颗粒之间的相互作用。但随着纳米技术的发展，有关于利用植物细胞的胞吞作用，将碳纳米管导入完整植物细胞的研究报道。但利用表面修饰后的Cdk/ZnS纳米颗粒穿过植物壁进入细胞内的研究未见报道。 同时利用CdS或CcKe等量子点材料作用于活体细胞的另一个问题是，CdS或CcKe等量子点材料会分解释放出有毒重金属离子Cd2+，结合线粒体蛋白质内巯基后，使蛋白失活。因此， 量子点表面涂层降解后的潜在生物毒性也不容忽视。但量子点材料对植物细胞毒理的研究尚未见报道。
技术实现思路
专利技术目的针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种Cdk/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法，以通过研究植物悬浮细胞与经不同条件表面化学修饰的纳米颗粒，在不同的共培养条件下相互作用的细胞生物学特征和细胞毒性等影响，为植物基因工程提供新型的无机纳米基因载体和转基因技术体系。技术方案为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下一种CcKe/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法取1 IOmL浓度为广5 X IO5个/mL 鹅掌楸单细胞悬浮液，放置于离心管中，加入10 50 μ L浓度为1 6 μ mol/L的Cdk/ZnS 水溶性量子点，控温20 37°C，5(Tl00r/min，摇床培养3 9h ；200(T4000r/m离心5 lOmin，弃上清，用细胞培养液洗去未被细胞内吞的Cdk/ZnS量子点，即可。所述的CcKe/ZnS量子点，尺寸为1 30nm以内，表面电荷性质为正电荷。优选加入CcKe/ZnS水溶性量子点后，再加入PEG-4000至质量浓度为20%。上述Cdk/ZnS水溶性量子点在以纳米基因载体建立高效的植物细胞转基因体系中的应用。本专利技术研究了鹅掌楸悬浮细胞和Cdk/ZnS量子点之间相互作用过程以及分析了 CdSe/ZnS量子点的细胞毒性，通过调控Cdk/ZnS量子点的表面电荷、培养时间和培养温度等条件，系统地探讨了两者之间的相互作用机理(1)纳米颗粒主要通过植物细胞膜的液相胞吞作用进入其细胞内部，尺寸合适的外源物质进入植物细胞的困难并非细胞壁本身， 而在于细胞膜；(2) PEG介导作用可以增加植物细胞的摄入纳米颗粒的能力；(3)相对于 (-)CdSe/ZnS量子点，(+ ) CdSe/ZnS量子点作为鹅掌楸细胞的纳米基因载体更具有优势， 共孵育时间广证以内为宜。因此，适用于植物细胞的量子点材料应该具备尺寸大小应该控制在30nm以内(植物细胞壁空隙在2(T40nm)；表面电荷性质应避免为负电荷，降低其自身的细胞毒性；还可以进一步通过生物偶联技术固定靶分子和细胞膜中相应的受体相互缔合，诱导细胞高效摄入；同时可以利用PEG等化学试剂增加细胞膜通透性，增加细胞摄入纳米颗粒的能力。此外，还可以利用超声、电刺激等物理手段来达到同一目的。有益效果与现有技术相比，本专利技术的显著优点是本专利技术采用不同条件对杂交鹅掌楸的胚性悬浮细胞与经不同表面化学修饰的Cdk/ZnS纳米颗粒之间进行共孵育，结果表明，在共孵育后池以内，激光共聚焦显微镜和电子扫描显微镜下，均可在细胞内部的表面观察到经表面后修饰带正电荷的Cdk/ZnS纳米颗粒，胞吞进入细胞内部的表面携带正电荷的Cdk/ZnS纳米颗粒的量明显与共培养时间、温度有明显的依赖关系，表明它们可以通过细胞的液相胞吞作用进入杂交鹅掌楸细胞内，且不影响细胞的活性，而表面带负电荷的Cdk/ZnS纳米颗粒则主要聚集在细胞外壁附近，在培养溶液中添加质量浓度比为20% 聚乙二醇，可进一步提高鹅掌楸细胞胞吞Cdk/ZnS纳米颗粒的量和减轻Cdk/ZnS纳米颗粒的细胞毒性。因此以表面携带正电荷的Cdk/ZnS量子点纳米材料作为基因载体，在植物悬浮细胞的转基因研究和应用中具有广泛的前景，能够为植物基因工程提供新型的无机纳米基因载体和转基因技术体系。附图说明图1是鹅掌楸细胞和(士)CdSe/ZnS量子点共孵育9h后典型的激光共聚焦显微镜图片。图中，(A) ( + )CcKe/ZnS :(a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(B) (-)CdSe/ ZnS (a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(C)大范围下的(+ ) Cdk/ZnS (a)荧光， (b)明场，(c)明场/荧光重叠；(D) (-) CdSe/ZnS (a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；图2是(士)Cdk/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育的不同时间阶段典型的激光共聚焦显微镜图片。图中，(A) ( + )CcKe/ZnS，3h :(a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(B) (+ ) CdSe/ZnS, 9h (a)荧光，(b)明场，(c)明场 / 荧光重叠；(C) ( + ) CdSe/ZnS, 24h (a) 荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(D) (-) CdSe/ZnS, 3h (a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(E) (_)CcKe/ZnS，9h :(a)荧光；(b)明场；(c)明场/荧光重叠；(F)(-) CdSe/ZnS, 24h (a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠;图3 ( + ) CdSe/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育池后电子SEM图片； 图4是(+ ) CdSe/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育池后能量谱分析图；图5是PEG介导(士)Cdk/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育的不同时间阶段典型的激光共聚焦显微镜图片；图中，(A) (a) ( + )Cc^e/ZnS，3h:①荧光，②明场，③明场/荧光重叠；(b) ( + )CcKe/ZnS，9h ①荧光，②明场，③明场/荧光重叠；(c) (l)CdSe/ZnS,3h 荧光，②明场，③明场/荧光重叠；(d) (-) CdSe/ZnS, 9h ①荧光，②明场，③明场/荧光重叠；(B)细胞的平均荧光强度和共孵育时间关系柱状图6是PEG介导(士)Cdk/ZnS量子点和鹅掌本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子点与植物细胞的共孵育方法，其特征在于：取１～１０ｍＬ浓度为１～５×１０５个／ｍＬ鹅掌楸单细胞悬浮液，放置于离心管中，加入１０～５０μＬ浓度为１～６μｍｏｌ／Ｌ的ＣｄＳｅ／ＺｎＳ水溶性量子点，控温２０～３７℃，５０～１００ｒ／ｍｉｎ，摇床培养３～９ｈ；２０００～４０００ｒ／ｍ离心５～１０ｍｉｎ，弃上清，用细胞培养液洗去未被细胞内吞的ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子点，即可。
【技术特征摘要】
1.一种Cdk/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法，其特征在于取1 IOmL浓度为广5X IO5个/mL鹅掌楸单细胞悬浮液，放置于离心管中，加入10 50 μ L浓度为 1 ~ 6ymol/L的CdSe/ZnS水溶性量子点，控温20 37 °C，5(Tl00r/min，摇床培养3 9h ； 200(T4000r/m离心5 lOmin，弃上清，用细胞培养液洗去未被细胞内吞的Cdk/ZnS量子点， 即可。...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏兵，董琛，陈金慧，施季森，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：84
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