一种红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法技术

本发明专利技术公开了一种红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法，它是在红豆杉细胞液体悬浮培养50代之后，第一阶段采用加广泛性弱调控剂硝酸银水溶液，使用浓度为1‑40 mM的弱调控方式继代，第二阶段采用强调控剂中强度调控方式进行紫杉醇及紫杉烷的生产；第二阶段所述的强调控剂指的是：冠菌素水溶液，使用浓度为10‑2000 nM，冠菌素加入的天数是1到8天或茉莉酸类乙醇溶液，使用浓度为10‑200 mM，茉莉酸加入的天数是1到8天。在继代阶段也加入弱调控剂，而生产阶段却降为中强度调控剂，如此长期培养中植物细胞培养达到了两个阶段的和谐衔接，最终获得了高产和稳产的紫杉醇、紫杉烷中间体10DAB和BAT III。

Regulation method for producing yew by long-term cultivation of Taxus cells

The invention discloses a control method of taxane production in a long-term culture of Taxus cells, it is after the Taxus cell suspension culture for 50 generations, the first stage with extensive weak regulation agent silver nitrate solution, concentration of weak regulation 1 40 mM subculture, the second stage is the emphasis on strength control agent in the regulation of taxol and taxane production; the second stage of the stress control agent refers to: coronatine aqueous solution concentration of 10 2000 nM days, coronatine added is 1 to 8 days or jasmonic acid ethanol solution, the concentration of 10 200 mM, jasmonic acid is added 1 days to 8 days. In the subculture stage also added weak regulation agent, while the production phase is reduced to the strength control agent, so the long-term culture in plant cell culture to reach the harmony and cohesion of the two phases, obtained high yield and stable yield of taxol and taxane intermediates 10DAB and BAT III.

【技术实现步骤摘要】
一种红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法
本专利技术属于生物制药中的植物细胞培养生产技术，具体涉及一种红豆杉细胞长期培养稳定生产紫杉烷的继代与调控方法。
技术介绍
红豆杉人工种植，周期长，产量低；在红豆杉植物细胞培养方面，由于次级代谢产物的对自身的毒性，细胞株长期继代过程中不稳定，次级代谢产物产量越来越低，大规模商业化生产面临极大困难。目前红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷的传统工艺是两阶段法。第一个阶段是无调控剂下，细胞在生长培养基下较快速的放大生长，主要目的是获得大量可用的植物细胞团生物量。第二个阶段是取一部分植物细胞团，以高接种量放入生产培养基中，在调控剂刺激下，生物合成次级代谢产物，比如表达各种紫杉烷，但同时这批细胞也走向死亡。两阶段培养法在植物细胞长期继代过程中发挥了重大作用，尤其是继代代次的前期和中期，但继代次数超过50代后，植物细胞越来越适应生长培养基，生长越来越快，比生长率越来越高，倍增越来越大，而同时对调控剂的响应却越来越低，而且对调控剂响应低或者敏感而凋亡。两阶段调控工艺只能解决植物细胞长期继代中的前中期产能问题，考虑到规模培养的植物细胞都是高代次的，都是位于长期继代中的后期，我们需要一种继代和调控方法，应付长期继代的植物细胞产能下降的问题。
技术实现思路
本专利技术采取了并发调控的策略，在传统的生长阶段也引入一定较低程度的弱调控方式，保持植物细胞系的生产能力，但也不影响比生长率的维持。在调控生产阶段，加入的是中强度调控策略，从而更稳定而高产的表达紫杉烷。与现有方案所不同的关键点在于：在植物细胞继代阶段，加入弱调控剂，维持次级代谢基因的低水平表达；而在终端的调控生产阶段，使用中强度的调控剂，在生长的初级代谢与次级代谢中达到了相对平衡，提高了生产系统的长期稳定性。为实现上述目的，本专利技术公开了如下的技术方案：（1）在红豆杉细胞液体悬浮培养50代之后，第一阶段采用加广泛性弱调控剂硝酸银水溶液，使用浓度为1-40mM（毫摩尔每升）的弱调控方式继代，第二阶段采用强调控剂中强度调控方式进行紫杉醇及紫杉烷的生产；（2）第二阶段所述的强调控剂指的是：冠菌素、甲基茉莉酸一种或两种的混合物；当使用冠菌素水溶液时浓度为10-2000nM（纳摩尔每升），冠菌素水溶液加入的天数是1到8天；当使用甲基茉莉酸乙醇溶液式浓度为10-200mM，甲基茉莉酸乙醇溶液加入的天数是1到8天；当联合使用冠菌素与甲基茉莉酸，其摩尔份数比为1:5000到1:10000。本专利技术所述的调控方法，其中的红豆杉细胞系为南方红豆杉细胞，经过50次的液体悬浮继代；接种的培养基为B5类型植物基础培养基，其配方：蔗糖起始浓度为20-35g/L，选优为25g/L；含6-BA为1-10mg/L，优选为2mg/L，含NAA为1到10mg/L，优选为4mg/L；接种量为100目筛网上的15-30g鲜活细胞，优选为20g鲜活细胞；培养避光，振荡培养，2cm旋距，100rpm。培养周期为14天；所述的鲜活细胞指的是：红豆杉液体悬浮培养的湿活细胞团。本专利技术第一阶段采用加广泛性调控剂硝酸银水溶液，优选使用浓度为5-20mM，特别优选为10mM。第二阶段采用调控剂冠菌素水溶液，优选使用浓度为100-1000nM，特别优选为500nM，冠菌素加入的天数优选2到6天，特别优选为第4天；调控剂甲基茉莉酸类乙醇溶液，使用浓度优选为100-100mM，特别优选为50mM。甲基茉莉酸加入的天数优选是2到6天，特别优选为第4天。强调控剂的使用有三种情况：单独使用冠菌素，单独使用甲基茉莉酸，联合使用这两者。原因是目前冠菌素太贵，虽然效果好，但考虑到经济原因，所以可以选择联合使用。本专利技术公开的第二阶段采用的培养基是MS基础盐，加入蔗糖起始浓度为35-70g/L，优选是50g/L；含6-BA为1mg/L，2,4-D为0.5mg/L。接种量是20-100g/L，优选是30-60g新鲜细胞/L（新鲜细胞指的是红豆杉液体悬浮培养的湿活细胞团）。本专利技术进一步公开了采用红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法在提高紫杉醇、紫杉烷中间体10DAB和BATIII产量方面的应用。试验结果显示（具体见实施例）：常规的两阶段（无调控-强调控）技术路线，紫杉醇的产量为54到0mg/L，10DAB和BATIII的产量未检出（小于3mg/L），细胞容易褐化死亡。采用本专利技术的方法（弱调控-中调控）后，紫杉醇产量为30-100mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BATIII的产量为30-200mg/L，生产体系比较稳定。本专利技术公开的红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法与现有技术相比其关键点在于：（1）红豆杉植物细胞长期继代的第50代之后，若还采用强调控生产方式，紫杉醇产量会跌落到0-50mg/L，其他紫杉醇中间体产量接近0；若还采用弱强度继代方式与中强度调控生产方式，紫杉醇产量升到30-100mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BATIII的产量为30-200mg/L。（2）在继代阶段也加入弱调控剂，而生产阶段却降为中强度调控剂，如此长期培养中植物细胞培养达到了两个阶段的和谐衔接，最终获得了高产和稳产的兼顾。附图说明图1为传统不平衡两阶段（无调控-强调控）技术路线；图2为本专利相对平衡（弱调控-中调控）技术路线。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所用原料及试剂均有市售。红豆杉植物细胞见专利CN201410726199.6，使用的是一种具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株（Taxuswallichianavar.mairei），命名为：南方红豆杉植物细胞系NO51-3，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNo.10002。实施例1红豆杉植物细胞新线在摇瓶初期阶段的无调控继代方式一：红豆杉细胞南方红豆杉固体O38-2-2线转为悬浮第25代摇瓶线悬浮培养物，编号为81#线的种子线，使用500mL容量的摇瓶，装液量为100mL新鲜的B5培养基，蔗糖起始浓度为15g/L，含6-BA为1mg/L，2,4-D为0.5mg/L，接种量为100目筛网上的10g鲜活细胞，避光，振荡培养，2cm旋距，100rpm。培养14天后，进行继代，鲜活细胞倍增比例为2.68。实施例2红豆杉植物细胞在摇瓶中期阶段的无调控继代方式二：红豆杉细胞南方红豆杉固体O38-2-2线转为悬浮第48代摇瓶线悬浮培养物，编号为81#线的种子线，采用实施例1的培养方式。在培养14天后，进行继代，鲜活细胞倍增比例增加到2.92。实施例3红豆杉植物细胞在摇瓶后长期阶段的弱调控继代方式三：红豆杉细胞南方红豆杉固体O38-2-2线转为悬浮第85代摇瓶线悬浮培养物，编号为81#线的种子线。使用500mL容量的摇瓶，装液量为100mL新鲜的B5培养基，蔗糖起始浓度为20g/L，含6-BA为1.5mg/L，接种量为100目筛网上的16g鲜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）在红豆杉细胞液体悬浮培养50代之后，第一阶段采用加广泛性弱调控剂硝酸银水溶液，使用浓度为1‑40 mM的弱调控方式继代，第二阶段采用强调控剂中强度调控方式进行紫杉醇及紫杉烷的生产；（2）第二阶段所述的强调控剂指的是：冠菌素、甲基茉莉酸一种单独使用或两种的混合物；当使用冠菌素水溶液时浓度为10‑2000 nM，冠菌素水溶液加入的天数是1到8天；当使用甲基茉莉酸乙醇溶液式浓度为10‑200 mM，甲基茉莉酸乙醇溶液加入的天数是1到8天；当联合使用冠菌素与甲基茉莉酸，其摩尔份数比为1:5000到1:10000。

【技术特征摘要】
1.一种红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）在红豆杉细胞液体悬浮培养50代之后，第一阶段采用加广泛性弱调控剂硝酸银水溶液，使用浓度为1-40mM的弱调控方式继代，第二阶段采用强调控剂中强度调控方式进行紫杉醇及紫杉烷的生产；（2）第二阶段所述的强调控剂指的是：冠菌素、甲基茉莉酸一种单独使用或两种的混合物；当使用冠菌素水溶液时浓度为10-2000nM，冠菌素水溶液加入的天数是1到8天；当使用甲基茉莉酸乙醇溶液式浓度为10-200mM，甲基茉莉酸乙醇溶液加入的天数是1到8天；当联合使用冠菌素与甲基茉莉酸，其摩尔份数比为1:5000到1:10000。2.权利要求1所述的调控方法，其中的红豆杉细胞系为南方红豆杉细胞，经过50次的液体悬浮继代；接种的培养基为B5类型植物基础培养基，其配方：蔗糖起始浓度为20-35g/L；含6-BA为1-10mg/L，含NAA为1-10mg/L；接种量为100目筛网上的15-30g鲜活...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁靖志，刘晓月，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：天津艾赛博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12