具有β‑木糖苷酶和β‑葡萄糖苷酶双重活性的糖基水解酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一系列糖基水解酶LXYL‑P1突变体蛋白，这些突变体蛋白具有β‑木糖苷酶和/或β‑葡萄糖苷酶活性，均能专一性地从7‑木糖紫杉烷类化合物上水解去除木糖基，本发明专利技术涉及这些突变体的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列，以及这些突变体蛋白及其产生菌的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种双功能糖基水解酶(GH)的一系列突变体。这些突变体的β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性较之其野生型有所提高，并且均能专一性地从7-木糖紫杉烷类化合物上水解去除木糖基，本专利技术涉及这些突变体的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列，以及这些突变体蛋白及其产生菌的应用。技术背景糖基水解酶(glycoside hydrolases，GH；glycosidases，EC3.2.1.X)可催化糖苷化合物的水解反应，在食品、造纸、药品、饲料及生物能源等领域具有广泛的用途。根据其氨基酸序列和结构特征进行分类，GH目前累计有100多个家族(http://www.cazy.org/)，而GH3是上述100多个家族中最大的家族之一，已发现2400余个成员。β-木糖苷酶(β-D-xylosidases，EC3.2.1.37)作用于木糖苷化合物和木寡糖或木二糖的非还原末端，释放出β-D-木糖和相应的配基。已发现的β-木糖苷酶属于糖基水解酶的3、30、39、43、52和54家族[Brunzelle,J.S.et al.Structure of the two-subsite beta-D-xylosidase from Selenomonas ruminantium in complex with 3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propane.Arch Biochem Biophys.2008,474:157-166]，而真菌来源的β-木糖苷酶目前见于GH3、43和54家族[Knob,A.et al.β-xylosidase from filamentous fungi:an overview.World J Microb Biot.2010,26:389-407]。β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidases，EC3.2.1.21)，则作用于纤维素、纤维二糖和葡萄糖苷化合物的非还原末端，释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。已发现的β-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶的1、3、5、9、30、116家族[Michlmayr,H.et al.β‐Glucosidase activities of lactic acid bacteria:mechanisms,impact on fermented food and human health.FEMS Microbiol Lett.2013,352(1):1-10.]，而真菌来源的β-葡萄糖苷酶见于GH3家族[Tiwari,P.et al.β-Glucosidases from the fungus Trichoderma:an efficient cellulase machinery in biotechnological applications.BioMed Res Int.2013,2013:203735.doi:10.1155/2013/203735]。有些糖基水解酶则同时具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的双重活性，例如，克隆自香菇(Lentinula edodes)的两个糖基水解酶(代号LXYL-P1-1、LXYL-P1-2，两者的氨基酸序列一致性为97％，后者活性较前者高)不仅具有β-木糖苷酶活性，能专一性地水解去除7-木糖紫杉烷类化合物上的木糖基(故又称之为7-木糖紫杉烷糖基水解酶)，还能水解β-葡萄糖苷，是一典型的双功能酶[Cheng,H.L.et al.Cloning and characterization of the glycoside hydrolases that remove xylosyl group from 7-β-xylosyl-10-deacetyltaxol and its analogues.Mol Cell Proteomics.2013,12(8):2236-2248]。其中，活性较高的LXYL-P1-2氨基酸序列及其应用已申请专利技术专利：朱平，程海立，赵瑞玉，程克棣，何慧霞，孟超，朱慧新.具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的新的糖基水解酶及其应用.专利号ZL 201180031238.5；PCT国际公布号WO 2011/160484 A1(美国专利公布号US 2013/0130330 A1)。本专利技术的申请者针对LXYL-P1-1与LXYL-P1-2中理化性质差异较大的氨基酸残基进行由LXYL-P1-1向LXYL-P1-2的定点及定点组合突变，发现针对特定氨基酸残基进行突变后，所制备得到的一些突变体的β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性较之LXYL-P1-1有显著提高；针对LXYL-P1-2进行的定向进化研究，也获得了β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性显著高于LXYL-P1-2的突变体；进一步研究发现，将野生型LXYL-P1-1和LXYL-P1-2以及上述所有突变体的第220位亮氨酸残基突变成甘氨酸残基(L220G突变)，获得的所有L220G突变体(或称L220G突变型)的β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性显著高于突变前的对照(第220位氨基酸残基为亮氨酸残基)。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一类糖基水解酶LXYL-P1(即本专利技术所述的糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2)系列突变体蛋白、编码该突变体蛋白的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的重组质粒、含有该核苷酸序列或重组质粒的重组细胞，以及以上所述的突变体蛋白、其核苷酸序列、其重组质粒或重组细胞在水解去除糖苷化合物上木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的应用。为解决本专利技术的技术问题，提供如下技术方案：本专利技术技术方案的第一方面是提供糖基水解酶LXYL-P1(即本专利技术所述的糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2)系列突变体蛋白，所述突变体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO 3～SEQ ID NO 13，以及上述氨基酸序列SEQ ID NO 3～SEQ ID NO 13和LXYL-P1-1的氨基酸序列SEQ ID NO 1、LXYL-P1-2的氨基酸序列SEQ ID NO 2的L220G突变型。本专利技术技术方案的第二方面是提供编码第一方面所述突变体蛋白的核苷酸序列，优选SEQ ID NO 16～SEQ ID NO 26所示的核苷酸序列，以及上述核苷酸序列SEQ ID NO 16～SEQ ID NO 26和Lxyl-p1-1的核苷酸序列SEQ ID NO 14、Lxyl-p1-2的核苷酸序列SEQ ID NO 15在C658T659C660→G658G659A660或G658G659T660或G658G659C660或G658G659G660的密码子突变型。本专利技术技术方案的第三方面是提供含有第二方面所述核苷酸序列的重组质粒。本专利技术技术方案的第四方面是提供含有第二方面所述核苷酸序列或第三方面所述重组质粒的重组细胞。构成该重组细胞的宿主细胞既可以是含有Lxyl-p1-1和Lxyl-p1-2野生型基因的香菇(Lentinula edodes)细胞，也可以是异源宿主细胞。适宜的宿主生物包括细菌、放线菌、丝状真菌、酵母菌、植物细胞、动物细胞，举例如下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糖基水解酶LXYL‑P1的突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白具有SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列；以及上述氨基酸序列或LXYL‑P1‑1的氨基酸序列SEQ ID NO 1、LXYL‑P1‑2的氨基酸序列SEQ ID NO 2的L220G突变型。

【技术特征摘要】
2015.05.25 CN 20151026848761.一种糖基水解酶LXYL-P1的突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白具有SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列；以及上述氨基酸序列或LXYL-P1-1的氨基酸序列SEQ ID NO 1、LXYL-P1-2的氨基酸序列SEQ ID NO 2的L220G突变型。2.根据权利要求1的糖基水解酶LXYL-P1的突变体蛋白，其特征在于，在糖基水解酶LXYL-P1的突变体蛋白上可进行常规修饰；或者在糖基水解酶LXYL-P1上还连接有用于检测或纯化的标签。3.根据权利要求2的糖基水解酶LXYL-P1的突变体蛋白，其特征在于，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰；所述的标签包括6×His、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。4.一种编码权利要求1所述突变体蛋白的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO 16～SEQ ID NO 26所示的核苷酸序列；以及SEQ ID NO 14～SEQ ID NO 26所示的核苷酸序列分别发生C658T659C660→G658G659A660或C658T659C660→G658G659T660或C658T659C660→G658G659C660或C658T659C660→G658G659G660的密码子突变得到的核苷酸序列。6.一种含有权利要求4-5任一所述核苷酸序列的重组质粒。7.一种含有权利要求4-5任一所述核苷酸序列或权利要求6所述重组质粒的重组细胞。8.根据权利要求7的重组细胞，其特征在于，构成所述重组细胞的原宿主细胞可以是产生包括SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 2所示序列的同源产生菌，或者是异源宿主细胞。9.根据权利要求8的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞的宿主生物选自细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、植物细胞或动物细胞。10.根据权利要求9的重组细胞，其特征在于，所述的细菌选自大肠埃希氏菌属(Escherichia species)、芽胞杆菌属(Bacillus species)；所述的放线菌选自链霉菌属(Streptomyces species)；所述的酵母菌选自毕赤酵母菌属(Pichia species)、酿酒酵母菌属(Saccharomyces species)和裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyce species)；所述的丝状真菌选自曲霉属(Aspergillus species)、木霉属(Trichoderma species)、青霉属(Penic...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱平，梁潇，王芬，李慧仙，陈天娇，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11