用于产生具有提高的植物疾病抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法技术

本发明专利技术涉及病原体的控制。本文中公开了产生具有提高的病原体抗性的转基因植物的方法、包含编码功能蛋白的多核苷酸的表达载体、以及转基因植物和由所述植物产生的种子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】 本申请要求2007年8月31日提交的美国临时专利申请系列号60/969，190和2008 年8月27日提交的EP08163071的优先权。 本专利技术涉及病原体的控制。本文中公开了产生具有提高的病原体抗性的转基因植 物的方法、包含编码功能蛋白的多核苷酸的表达载体，和转基因植物及由所述植物产生的 种子。 特别地，本专利技术涉及与相应的非转化野生型对照相比，通过提高或产生生物胁迫 相关蛋白(BSRP)的一种或多种活性而具有提高的致病真菌和/或线虫抗性的转基因植物 细胞、植物或其部分，并且涉及用于产生所述植物细胞、植物或其部分的方法。 本专利技术也涉及产生并筛选此类植物细胞或植物和对其育种的方法。 人口增加和气候变化已经使全球性食物、饲料和燃料短缺近年来成为突出的焦点 问题。此外在田间条件下，植物性能就生长、发育、生物量积累和产量而言取决于对环境变 化的适应能力和对植物疾病胁的耐受性。生物性和非生物性胁迫对作物产量产生严重影 响。病原体侵袭有时是最具毁灭性的生物胁迫。作物中疾病抗性的增强可以明显地帮助提 高作物的生产力并减少杀虫剂应用，其中所述杀虫剂在过量应用时可能不利地影响人类健 康和环境。植物疾病是由生物胁迫引起的传染病，但是非传染病由非生物胁迫引起。生物 胁迫由植物病原体，即相关细菌、真菌、线虫、病毒、柔膜细菌(支原体、螺旋体)、原生生物、 显花植物原虫、立克次氏体和类病毒、昆虫及寄生植物引起。非生物胁迫意指“次优生长条 件”，谈及环境性胁迫时，指因天气和其他环境因素、受限的水和营养物可获性和次优配置 性所致的损害。受限的水可获性可以诱导干旱、热、寒冷或盐胁迫。 植物传染病，换言之即生物胁迫，是世界范围内严重的作物损失原因，其中所述的 严重的作物损失因感染正在生长的植物和摧毁已收获的作物所致。由这些胁迫所致的主要 作物如稻、玉米(maize)(谷物(corn))和小麦的作物损失和作物产量损失代表重要的经济 和政治因素并且造成世界范围内粮食短缺。 农业生物技术已经通过能提高作物产量的植物基因修饰来满足人类日益增长的 需求，例如通过赋予更好的生物性和非生物性胁迫耐受性或通过增加生物量。植物针对病 原体的天然防御机制往往是不充分的。当前，已知众多遗传学和生物技术方法旨在获得生 物胁迫条件下生长的植物。 导入来自植物、动物或微生物源的外来基因可以增加所述防御。例子是通过表达 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素对抗昆虫摄食损害的保护作用(Vaeck 等人(1987)NatUre 328:33-37)或通过表达菜豆几丁质酶对抗真菌性感染的保护作用 (Broglie 等人(1991) Science254 :1194_1197)。 大部分病原体具有针对特定植物物种、属和科的宿主特异性。例如，月季黑斑病将 不侵袭万寿菊或芦笋。因此，大部分的所述方法仅针对单一病原体或狭窄范围的病原体提 供抗性。植物_病原体相互作用有时受病原体的无毒力基因与植物的基因-对-基因疾 病抗性(R)基因之间的特异性相互作用控制。多位作者已经报告通过转基因方法增强疾6病抗性，如增加植物的疾病抗性(R)基因表达。R基因介导抗性的特征性防御反应是超敏 应答(HR)，即包含受侵袭植物细胞的程序性细胞死亡的强烈抗性反应。抗微生物小肽作为 对抗传染性微生物的植物天然防御系统的部分发挥重要作用。抗微生物肽通常是小的、阳 离子的和两亲性的，并且具有开链形式。已经在植物中鉴定到多种类型的抗微生物肽，包括 硫素、玉米zeamatin、咖啡环杆菌素、小麦嘌呤吲哚蛋白和植物防御素(Kawata等人，JARQ 37(2)，71-76 (2003))。 仅存在向植物赋予更广泛范围病原体抗性的几种方法。全身获得性抗性 (SAR)-在多种植物/病原体相互作用中的一种防御机制-可以通过应用内源性信使物质如 茉莉酮酸(JA)或水杨酸(SA)而赋予(Ward 等人(1991)Plant Cell 3 =1085-1694 ；Uknes 等人(1992)Plant Cell 4(6) :645_656)。类似作用也可以由合成的化合物如2，6-二氯异 烟酸(INA)或S-甲基苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸酯(BTH ；Bion200) (Friedrich等 人(1996)Plant J10(l) :61_70 ;Lawton 等人(1996)Plant J. 10 71-82)实现。在 SAR 的 情况下发病机理相关(PR)蛋白的上调的表达也可以在一些情况下引起病原体抗性。 [10111]在大麦，Mlo基因的丢失引起提高且尤其是品种非特异的针对数量众多霉菌物种 的抗性(Buschges R 等人(1997)Cell 88 695-705 Jorgensen J H(1977)Euphytica 26: 55-62 ；Lyngkjaer M F 等人(1995)PlantPathol 44:786-790)。没有描述其他植物中、 尤其禾谷类物种中的mlo样抗性。描述了使用Mlo基因和来自其他禾谷类物种的同源物 以获得病原体抗性的多种方法(W098/04586 ；W000/01722 ；W099/47552)。不利之处在于 mlo-介导的防御机制包含叶细胞的自发死亡(WoIter M等人(1993)MolGen Genet 239 122-128)。另一个不利之处在于Mlo-缺陷基因型显示对半活体营养型病原体如稻瘟病菌 (Magnaporte grisea (M. grisea))禾口禾旋抱月空菌(Cochliobolus sativus (麦*艮腐平赃螺 孢(Bipolaris sorokiniana))的超敏感性(Jarosch B 等人(1999)Mol Plant Microbe Interact 12 508-514 ；Kumar J 等人(2001) Phytopathology 91 127-133)。 [11111]确定了活性氧类(R0S)的释放是对植物病原体反应中的重要保护功能 (ffojtaszek P(1997)。已经证实在拟南芥(Arabidopsisthaliana)NADPH氧化酶的催化亚 基中的突变显示活性氧中间体(R0I)的积累减少。就超敏感反应(HR)而言，结果是不一致 的无毒力细菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的感染在双重突变体中显出降低 的HR，而有毒力的卵菌纲(Oomycete)寄生霜霉(Peronospora parasitica)显出提高的HR。 在US 20080047033中，公开了用于通过降低NADPH氧化酶的表达、活性或功能来产生或增 加植物中病原体抗性的方法。另一种方法涉及发病机理相关蛋白(PRP)，尤其涉及转基因植物中编码PRP的 DNA序列的组成型表达。发病机理相关蛋白是病原体感染后诱导的植物蛋白。此类PRP 在US 20080120747或US 20080090294中公开，其中这些杀线虫及抗真菌多肽的物种源 是植物物种。参与植物抗性的其他植物基因从例如US 7, 320, 892 ；US 20080184397或US 20070226839 本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和／或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其中所述方法包括步骤：ａ）向植物细胞导入编码来自酵母和／或埃希氏菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）的“疾病抗性赋予蛋白”ＤＲＣＰ的多核苷酸；ｂ）从该植物细胞产生表达所述多核苷酸的转基因植物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2008-8-27 08163071.7;US 2007-8-31 60/969,190用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其中所述方法包括步骤a)向植物细胞导入编码来自酵母和/或埃希氏菌属(Escherichia)的“疾病抗性赋予蛋白”DRCP的多核苷酸；b)从该植物细胞产生表达所述多核苷酸的转基因植物。2.根据权利要求1的方法，其中所述的DRCP具有选自以下的活性GTP酶、非必需的小 GTP酶、转录调节物gabP 3，区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR 家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白。3.用于通过提高或产生一种或多种选自以下的活性，产生与相应的非转化野生型对照 相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转 基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述活性选自GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物 gabP 3，区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA 的转录性双重调节蛋白。4.根据权利要求3的方法，其中提高或产生至少一种多肽的活性，所述多肽包含选自 以下的多肽(i)分别包含表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或至少一个多肽 基序的多肽；或(ii)包含表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子的表达产物，或者(iii)(i)或(ii)的功能等同物。5.权利要求1或3所述的方法，其中增加或产生至少一种核酸分子的表达，所述核酸分 子包含选自以下的核酸分子a)核酸分子，其编码在表II第5列或第7列中显示的或包含表II第5列或第7列中 所示多肽的多肽；b)表I第5列或第7列中所示的核酸分子；c)核酸分子，其能够因遗传密码的简并性从表II第5列或第7列中所述的多肽序列衍 生并且赋予与相应的非转化野生型对照、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、 优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；d)核酸分子，其与包含在表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子 序列具有至少30%同一性并且赋予与相应的非转化野生型对照、植物或其部分相比较而言 提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；e)核酸分子，其编码多肽并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部 分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述 多肽与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30%同一性并具有由包 含表II第5列中所描述多核苷酸的多肽所代表的活性；f)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予与相应的非 转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的 致病性真菌和/或线虫抗性；g)编码多肽并具有由包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性的核酸分子，其中所述多肽能够借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽所制备的单克隆 或多克隆抗体分离；h)编码多肽的核酸分子，其中所述多肽包含表IV第7列中所示的共有序列或一个或多 个多肽基序并且优选地具有由包含表II或表IV的第5列中所述多肽的蛋白质所代表的活 性；i)核酸分子，其编码具有表II第5列中描述的蛋白质所代表活性的多肽并且赋予与相 应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地 提高的致病性真菌和/或线虫抗性；j)核酸分子，其包含通过使用表III第7列中的引物扩增cDNA文库或基因组文库所获 得的多核苷酸并且优选地具有由包含表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性，和k)通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下 筛选合适的核酸文库能够获得的核酸分子，其中所述的片段具有与在(a)至(e)中表征并 编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选地至少20nt、30nt、50nt、 100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活 性。6.权利要求1或3所述的方法，其中与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高 的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物 或其部分衍生自单子叶植物。7.权利要求1或3所述的方法，其中与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高 的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物 或其部分衍生自双子叶植物。8.权利要求1或3任一项的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、 稻、大麦、大豆、落花生、棉属植物、包括卡诺拉油菜和冬油籽油菜在内的油籽油菜、谷物、木 薯、辣椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花...

【专利技术属性】
技术研发人员：M弗兰克，G普勒舍，P普齐奥，R阿申齐，V米腾多夫，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]