【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在植物中产生高水平PUFA的改进方法本专利技术涉及用于产生基因修饰植物的材料和方法，特别地所述植物用于产生至少一种不饱和或多不饱和脂肪酸。本专利技术还涉及鉴定向植物或植物细胞传递不饱和脂肪酸代谢特性的基因，并且总体上涉及磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)领域。极长链多不饱和脂肪酸(VLC-PUFA)，如花生四烯酸(ARA；20:4ω6)、二十碳五烯酸(EPA；20:5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA；22:6ω3)、对人类健康具有可显示的益处(Swanson等人,2012；Haslam等人,2013)，但人类不能以足够量合成这些脂肪酸。转基因油料作物是VLC-PUFA的备选来源：这类系统最少地需要两个去饱和步骤和一次延伸，以使植物衍生的亚油酸(LA；18:2ω6)和ALA转化成VLC-PUFA(Venegas-Caleron等人,2010)。在植物中产生不常见脂肪酸时，通过诸如酰基-CoAPC、DAG和TAG等汇集物池改进脂肪酸流量特别有意义(Wu等人,2005)已经显示埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata)具...
【技术保护点】
1.原料种子油，其中/ni.二酰甘油(DAG)级分中以％(w/w)计的18:2脂肪酸水平介于三酰甘油(TAG)级分中以％(w/w)计的18:2脂肪酸水平的75％和130％之间/nii.三酰甘油组合物中以％(w/w)计的20:0水平低于二酰甘油级分中以％(w/w)计的20:0水平，/niii.三酰甘油组合物中以％(w/w)计的DGLA水平约等于或低于二酰甘油级分中以％(w/w)计的DGLA水平，/niv.三酰甘油级分中以％(w/w)计的22:1水平低于二酰甘油级分中以％(w/w)计的22:1水平，/nv.ALA和LA水平低于C18、C20和C22 PUFA的水平、/nvii....
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180907 EP 18193294.8;20180911 EP 18193835.81.原料种子油，其中
i.二酰甘油(DAG)级分中以％(w/w)计的18:2脂肪酸水平介于三酰甘油(TAG)级分中以％(w/w)计的18:2脂肪酸水平的75％和130％之间
ii.三酰甘油组合物中以％(w/w)计的20:0水平低于二酰甘油级分中以％(w/w)计的20:0水平，
iii.三酰甘油组合物中以％(w/w)计的DGLA水平约等于或低于二酰甘油级分中以％(w/w)计的DGLA水平，
iv.三酰甘油级分中以％(w/w)计的22:1水平低于二酰甘油级分中以％(w/w)计的22:1水平，
v.ALA和LA水平低于C18、C20和C22PUFA的水平、
vii.ALA和LA水平低于SDA、ETA、GLA、HGLA、EPA、DHA和DPA水平，
viii.ALA和LA水平低于C18脂肪酸和包含vlcPUFA的脂肪酸的水平，和/或
ix.ALA和LA水平低于SDA、ETA、GLA、HGLA、EPA、DHA和DPA水平。
2.产生植物、其部分、植物细胞和/或植物种子油的方法，其中ALA和LA水平低于C18、C20和C22PUFA的水平，包括与对照相比，在植物、其部分、植物细胞和/或植物种子中增加一种或多种PDCT的活性，其中所述PDCT选自：
(a)与SEQIDNO:36、38和/或48具有至少80％序列同一性的PDCT19；
(b)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸与SEQIDNO:35、37和/或47具有至少80％序列同一性；
(c)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码SEQIDNO:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交；
(d)SEQIDNO:36、38和/或48的PDCT19的变体，其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有PDCT19活性；
(e)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于SEQIDNO:35、37和/或47；和
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的PDCT19的片段，其具有PDCT19活性；
并且，任选地，分离种子油。
3.在能够产生DPA、DHA和/或EPA并且表达Δ-6去饱和酶和Δ-6延伸酶的植物、植物细胞和/或种子中增加DPA、DHA和/或EPA水平的方法，包括向植物、其部分、植物细胞和/或植物种子提供一种或多种PDCT的增加活性或表达，所述PDCT选自：
(a)与SEQIDNO:36、38和/或48具有至少80％序列同一性的PDCT19；
(b)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸与SEQIDNO:35、37和/或47具有至少80％序列同一性；
(c)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码SEQIDNO:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交；
(d)SEQIDNO:36、38和/或48的PDCT19的变体，其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有PDCT19活性；
(e)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于SEQIDNO:35、37和/或47；和
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的PDCT19的片段，其具有PDCT19活性。
4.在植物、植物细胞、植物种子或其部分中产生SDA、ETA、GLA、HGLA、EPA、DHA和/或DPA的方法，其包括提供能够产生SDA、ETA、GLA、HGLA、EPA、DHA和/或DPA的植物、种子或植物细胞且所述植物、种子和/或植物细胞功能性表达：
编码Δ-12去饱和酶活性的至少一种核酸序列
编码ω3去饱和酶活性的至少一种核酸序列，和
编码Δ-6-去饱和酶活性的至少一种核酸序列，和
编码Δ-6延伸酶活性的至少一种核酸序列，和
编码Δ-5去饱和酶活性的至少一种核酸序列，和
编码Δ-5延伸酶活性的至少一种核酸序列，和
编码Δ-4去饱和酶活性的至少一种核酸序列，和
其中至少一种去饱和酶使用磷脂作为底物，从而植物具有一种或多种PDCT的增加活性，其中植物具有增加活性的一种或多种PDCT选自：
(a)与SEQIDNO:36、38和/或48具有至少80％序列同一性的PDCT19；
(b)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸与SEQIDNO:35、37和/或47具有至少80％序列同一性；
(c)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码SEQIDNO:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交；
(d)SEQIDNO:36、38和/或48的PDCT19的变体，其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有PDCT19活性；
(e)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于SEQIDNO:35、37和/或47；和
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的PDCT19的片段，其具有PDCT19活性。
5.在油料作物植物中产生vlcPUFA的方法，包括
提供能够产生所需vlcPUFA的第一油料作物植物变种，
提供具有一种或多种PDCT的增加活性的第二油料作物植物变种，所述PDCT选自：
(a)与SEQIDNO:36、38和/或48具有至少80％序列同一性的PDCT19；
(b)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸与SEQIDNO:35、37和/或47具有至少80％序列同一性；
(c)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码SEQIDNO:36、38和/或48的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交；
(d)SEQIDNO:36、38和/或48的PDCT19的变体，其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有PDCT1活性；
(e)由多核苷酸编码的PDCT19，所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于SEQIDNO:35、37和/或47；和
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的PDCT19的片段，其具有PDCT19活性；
使第一和第二油料作物植物变种杂交，
任选地，测量衍生自杂交的第一代或后代细胞、种子、植物或其部分中的PDCT19表达率，
任选地，测量衍生自杂交的第一代或后代细胞、种子、植物或其部分中的总PUFA水平，
任选地，重复步骤2至5，
种植并培育植物，并且
从衍生自杂交的第一代或后代植物的种子分离包含vlcPUFA的油。
6.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中SDA、ETA、GLA、HGLA、EPA、DHA和/或DPA在植物、植物细胞和/或种子或其部分中产生。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中EPA、DPA和/或DHA的水平、优选地总的新PUFA的水平增加。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中表达选自Δ-5-、Δ-5/Δ-6-和Δ-6延伸酶的至少一种酰基-CoA依赖性延伸酶。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中ALA的水平与对照相比减少至少5％。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中植物、种子或植物细胞衍生自油籽作物，例如欧洲油菜(B.napus)、芥菜(B.juncea)、亚麻荠(C.sative)或埃塞俄比亚芥(B.carinata)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中PDCT活性增加，在于欧洲油菜、芥菜、亚麻荠或埃塞俄比亚芥种子或植物细胞分别衍生自欧洲油菜、芥菜、亚麻荠或埃塞俄比亚芥。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中ALA和LA水平低于SDA、ETA、GLA、HGLA、EPA、DHA和DPA的水平。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中植物、植物种子或植物细胞表达至少一种磷脂依赖性去饱和酶，优选地所述去饱和酶选自Δ-4-、Δ-5-、Δ-6-、ω-3去饱和酶和Δ-12去饱和酶，和至少选自Δ-5-、Δ-5Δ-6-和Δ-6延伸酶的延伸酶。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中植物、植物种子或植物细胞至少表达至少一种磷脂依赖性Δ6-去饱和酶和/或一种磷脂依赖性ω3去饱和酶。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中植物、植物种子或植物细胞至少表达至少一种磷脂依赖性Δ6-去饱和酶和/或一种磷脂依赖性ω3去饱和酶；和酰基CoA依赖性去饱和酶。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中PDCT1和/或PDCT19的活性增加。
17.产生植物原料油的方法，包括从种子分离原料油，所述种子衍生自根据前述权利要求中任一项所述的方法产生的植物。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种PDCT3和/或PCT5的活性与对照相比降低。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一种PDCT的活性降低，所述PDCT选自
(a)与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60具有至少80％序列同一性的PDCT3；
(b)由多核苷酸编码的PDCT3，所述多核苷酸与SEQIDNO:17、19、21、23、27、29、31、49、51、53、55和/或57具有至少80％序列同一性；
(c)由核苷酸编码的PDCT3，所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交；
(d)SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、50、52、54、56、58和/或60的PDCT3的变体，其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有PDCT活性；
(e)由多核苷酸编码的PDCT3，所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于SEQIDNO:17、19、21、23、27、29、31、49、51、53、55和/或57；和
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的PDCT的片段，其具有PDCT3活性。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中总PUFA水平增加。
21.产生原料植物油的方法，其中ALA和LA水平低于低于C18脂肪酸和包含vlcPUFA的脂肪酸的水平，包括前述权利要求中任一项所述的方法的步骤，提供种子并从所述种子分离油或脂肪酸。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中将分离的脂肪酸组合物、游离脂肪酸或植物油或植物种子油进一步加工并配制成食物或饲料组合物。
23.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，包括在植物或植物细胞中进一步表达PDCT1并且其中一种或多种PDCT选自
(a)与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46具有至少80％序列同一性的PDCT1；
(b)由多核苷酸编码的PDCT1，所述多核苷酸与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、39、41、43和/或45具有至少80％序列同一性；
(c)由多核苷酸编码的PDCT1，所述多核苷酸在高严格性条件下与(i)编码SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46的氨基酸序列的多核苷酸或(ii)(i)的全长互补物杂交；
(d)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46的PDCT1的变体，其在一个或多个位置包含置换、优选地保守性置换、缺失和/或插入并且具有PDCT活性；
(e)由多核苷酸编码的PDCT1，所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、39、41、43和/或45；和
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的PDCT的片段，其具有PDCT1活性；
和其中所述PDCT1在异源启动子控制下表达。
24.分离的、合成的或重组的多核苷酸，包含：
(a)与SEQIDNO:35、37和/或47具有至少80％序列同一性的核酸序列，其中核酸编码具有PDCT19活性的多肽；
(b)编码与SEQIDNO:36、38和/或48具有至少80％序列同一性的多肽的核酸序列，其中多肽具有PDCT19活性；
(c)(a)或(b)的片段，其中片段编码具有PDCT19活性的多肽；或
(d)与(a)至(c)中任一者完全互补的核酸序列。
25.分离的、合成的或重组的多核苷酸，包含根据权利要求24所述的多核苷酸，和：
(a)与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、39、41、43和/或45具有至少80％序列同一性的核酸序列，其中核酸编码具有PDCT1活性的多肽；
(b)编码多肽的核酸序列，所述多肽与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、40、42、44和/或46具有至少80％序列同一性，其中多肽具有PDC...
【专利技术属性】
技术研发人员：T·森杰，杨惠，P·弗伦坦，C·安德烈，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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