一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明专利技术在已建立完善的杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系﹑且已获得部分转录组数据的基础上，同源克隆获得杂交鹅掌楸LhMKK2基因全长，命名为LhMKK2，通过基因表达分析，证明了杂交鹅掌楸LhMKK2基因在植物中的广泛表达，参与植株的生长发育，以及逆境胁迫响应过程，通过对其功能分析发现，过表达LhMKK2基因增强植株对盐胁迫响应的抗性，影响植株的生长发育，可为开展杂交鹅掌楸抗逆性分子育种提供理论依据，并进一步在植物抗逆境胁迫中有较广泛的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用。
技术介绍
杂交鹅掌楸是南京林业大学著名林木遗传育种学家叶培忠教授等人利用中国马褂木（L.chinese（HEMSL.）Sarg）与北美鹅掌楸（L.tulipiferaLinn.）杂交试验获得的种间杂交种，具有明显的杂种优势。杂交鹅掌楸因其生长速度快，抗病虫害强，材质纹理细腻，叶形奇特，生长速度快，是集荒山造林、工业用材、园林观赏的优良树种，也被用于庭院绿化，造林和用材树种，市场潜力大。目前杂交鹅掌楸主要通过扦插、嫁接等传统无性繁殖方法及人工杂交的有性繁殖方式进行繁殖，但因为受到季节和杂交制种效率的影响，限制了优良杂种植株的繁殖，传统的育苗繁殖方式，速度缓慢，优良种苗数量远远供不应求，影响杂交鹅掌楸的应用及推广。陈金慧等以杂交鹅掌楸未成熟胚为培养材料，在固体培养基上成功诱导体细胞胚，建立了体细胞胚胎发生技术，并成功进入后期工厂化生产，从根本上提高了传统育种方法的缓慢育苗速度和方式。通过后期研究的不断优化，完善了杂交鹅掌楸胚性细胞的悬浮培养体系，为开展高等木本植物的生长、发育、调控途径和抗逆性等基础实验研究，提供了大量技术基础和试验材料基础。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinase，MAPK）级联路径在真核生物中高度保守，是介导植物细胞外信号传递至细胞内引起细胞响应的重要信号转导路径，在细胞分化和发育过程中，激素，多种生物和非生物胁迫中发挥重要作用。MAPK通路通常由三种三级级联激酶参与信号转导，包括促分裂原活化蛋白激酶的激酶之激酶（mitogen-activatedproteinkinasekinasekinases，MAPKKK，简称MEKK）；促分裂原活化蛋白激酶的激酶（mitogen-activatedproteinkinasekinases，MAPKK，简称MEK或MKK）以及促分裂原活化蛋白激酶MAPK，依次通过逐级磷酸化激活下游信号，将细胞外部多种类型刺激信号传递至细胞核内，进而引起细胞响应，参与介导细胞的生长、发育、分裂、分化、凋亡等多种过程，甚至生长素、脱落酸、乙烯和细胞分裂素的代谢，协同参与植物逆境胁迫响应。因此，二级级联激酶MAPKK家族参与植物的生长发育，激素信号转导，以及植物抗逆性胁迫响应过程。目前，通过对拟南芥基因组序列分析，已鉴定出80个MAPKKK基因，10个MAPKK基因，20个MAPK基因，这些基因也广泛存在于其它植物基因组中。比如，杨树中已鉴定出21个MAPK基因和11个MAPKK基因，水稻中有15个MAPK基因和8个MAPKK基因，75个MAPKKK基因。另外，目前已在许多物种中分离到MAPKK家族基因，如小麦，油菜，水稻，欧芹，烟草等。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种杂交鹅掌楸MKK2基因。本专利技术的另一目的是提供一种上述杂交鹅掌楸LhMKK2基因的表达蛋白。本专利技术还有一目的是提供杂交鹅掌楸LhMKK2基因在杂种鹅掌楸抗逆性分子育种中的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的杂交鹅掌楸LhMKK2基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的杂交鹅掌楸LhMKK2基因在杂交鹅掌楸抗逆性分子育种中的应用。所述的含有杂交鹅掌楸LhMKK2基因的载体或宿主细胞。MAPKK家族基因在MAPK级联路径中起“承上启下”的作用，是上下游信号转导通路的交叉点，拟南芥中，MKK2基因参与茉莉酸、水杨酸等激素信号转导过程，以及MEKK1-MKK2-MPK4/MPK6；MKK2-MPK4级联路径，是对低温、盐胁迫应答信号转导的组成部分，也参与植物的生长发育过程。本专利技术是在已建立成熟的杂交鹅掌楸体胚发生体系的基础上，同源克隆促分裂原活化蛋白激酶之激酶LhMKK2基因全长。有益效应：与现有技术相比，本专利技术是在已建立的完善的杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系的基础上，通过对杂交鹅掌楸MAPKK家族基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，基因的遗传转化等手段，分析验证其功能，证明了杂交鹅掌楸LhMKK2基因参与植物体细胞胚胎发生过程，过表达LhMKK2基因能够提高植株对盐胁迫响应的抗性，影响植株的生长发育，因此可用于提高植株的抗逆性胁迫响应，为杂交鹅掌楸的抗逆性分子育种提供依据，有很好的工业应用前景。附图说明图1是杂交鹅掌楸叶片总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；图2是LhMKK2基因全长PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；图3是目的片段双酶切反应的1%琼脂糖凝胶电泳图；图中，M：DL2000Marker；a，b：LhMKK2与pMDTM19-TVector连接载体用XbaI，SacI双酶切反应；图4是空表达载体pBI121双酶切反应的1%琼脂糖凝胶电泳图；图中，a：空载体PBI121质粒用XbaI，SacI双酶切反应；M1：DL2000Marker；M2：从上到下条带大小分别为：23130bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp，2027bp，564bp；图5是构建好的LhMKK2过表达载体图；图6是LhMKK2基因在不同部位的实时定量结果图；图中，1：雄蕊；2：根；3：茎；4：叶；5：芽；6：花；7：花瓣；8：雌蕊；图7是LhMKK2基因在不同时期的实时定量结果图；图中，1：胚性愈伤组织；2：液体悬浮培养7d；3：过渡培养期；4：球形胚；5：鱼雷胚；6：早期子叶胚；7：成熟子叶胚；图8是T1、T2代阳性植株PCR检测结果图；图中，p：LhMKK2+PBI121的重组质粒，阳性对照；M：DL2000Marker；1-12转基因植株的PCR产物；a，b：野生型拟南芥扩增的PCR产物，阴性对照；c：水，空白对照；图9是T1代LhMKK2转基因株系与野生型Ler的生长情况图；图中，A：LhMKK2转基因株系；B：野生型Ler；C：LhMKK2转基因株系的侧枝；D：野生型Ler的侧枝；图10是T1代LhMKK2转基因株系与野生型Col的生长情况图；图中，A，B，C：LhMKK2转基因株系；D：野生型Col；E，F：LhMKK2转基因株系的叶片；图11是过表达LhMKK2转基因拟南芥T2代植株生长统计图；图12是盐胁迫下T2代转基因植株和野生型Col的生长情况图；图中，A：野生型拟南芥对照；B：200mmol/LNaCl下野生型拟南芥；C：转基因植株对照；D：200mmol/LNaCl下转基因植株；图13是盐胁迫下第七天野生型和转基因植株生长情况图；图中，A：200mmol/LNaCl下野生型拟南芥；B：200mmol/LNaCl下转基因植株。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1以杂交鹅掌楸植株为材料，提取总RNA，并反转录成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，与pMDTM19-TVector（TakaraD102A）载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。挑取阳性克隆进行质粒抽提，添加适当酶切位点后与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的杂交鹅掌楸LhMKK2基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：施季森，赵芳芳，陈金慧，王鹏凯，郝兆东，闫珊，施帅男，孟岩，陆叶，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32