一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法技术

本发明专利技术公开了一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法，采用弱酸处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子；用悬浮液喷雾接种水稻叶片；于不同时间点取样，提取水稻样品总RNA；反转录成cDNA，real‑time RT‑PCR检测cDNA；分析PCD途径相关的主要基因PR1a和PR5在不同时间点的表达。与现有技术相比，本发明专利技术克服了研究非生物环境pH影响寄主‑病原互作机制中，常借助温室设计各种弱酸处理以观察寄主表型变化、以及筛选大量水稻防御相关基因表达等周期长和效率低的弊端，提供了一种更为简便、有效、准确地弱酸处理病原菌孢子、定量检测水稻PCD途径主要相关基因表达的方法，为更快速准确地进行弱酸对水稻与稻瘟病菌互作机制的研究提供重要的实验依据。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法
本专利技术属于植物保护和生物
，尤其涉及一种弱酸抑制稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法。
技术介绍
为了成功侵入寄主，侵染过程中，灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)在寄主的不同组织分泌不同的蛋白。尽管一些“真正的”毒性因子能成功抑制寄主防御响应，但需要不同的胞外分泌蛋白协同起作用。灰葡萄孢菌株的分泌组研究表明，在pH4和pH6条件下，灰葡萄孢菌株培养液呈现黑色的原因是菌丝在生长过程中产生的有色次生代谢产物所致。Louis等人研究发现，新月旋腔孢菌培养过程中的培养液出现淡黄色和乳白色，以及菌丝的黑化，是由于其除了分泌包括有色次生代谢产物外，还伴有候选效应蛋白的分泌。研究还表明，黑色素水平较高的新月旋腔孢菌株比黑色素水平较低的菌株具有更强的毒性，黑色素和相关次生代谢产物是新月旋腔孢菌株的毒性因子。对定殖于寄主组织上的新月旋腔孢菌菌丝进行观察发现，棕黑色的色素可能是新月旋腔孢菌在高温条件下维持其毒性必需的适应性特性。有研究发现色素合成和热激响应相关蛋白在新月旋腔孢菌定殖寄主过程中表达上调。pH是影响真菌分泌不同效应蛋白以促进其在寄主组织内定殖的重要环境因素。而pH是如何影响病原菌与寄主互作过程中寄主对不同pH环境响应的抗病机制(例如SA途径、JA途径及PCD途径的响应)？目前尚未有这方面的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：本专利技术包括以下步骤：(1)采用弱酸pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子；(2)用悬浮液喷雾接种水稻叶片；(3)于0h,24h,48h,72h和96h五个时间点取样，提取水稻样品总RNA；(4)反转录成cDNA，real-timeRT-PCR检测cDNA；(5)分析PCD途径相关的主要基因PR1a和PR5在不同时间点的表达。本专利技术的有益效果在于：本专利技术是一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法，与现有技术相比，本专利技术弱酸处理病原菌孢子后喷雾接种水稻叶片对水稻PCD途径主要相关基因表达的影响。它克服了研究非生物环境pH影响寄主-病原互作机制中，常借助温室设计各种弱酸处理以观察寄主表型变化、以及筛选大量水稻防御相关基因表达等周期长和效率低的弊端，提供了一种更为简便、有效、准确地弱酸处理病原菌孢子、定量检测水稻PCD途径主要相关基因表达的方法，为更快速准确地进行弱酸对水稻与稻瘟病菌互作机制的研究提供重要的实验依据。具体实施方式下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术包括以下步骤：(1)采用弱酸pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子；(2)用悬浮液喷雾接种水稻叶片；(3)于0h,24h,48h,72h和96h五个时间点取样，提取水稻样品总RNA；(4)反转录成cDNA，real-timeRT-PCR检测cDNA；(5)分析PCD途径相关的主要基因PR1a和PR5在不同时间点的表达。本专利技术中弱酸处理稻瘟菌孢子、稻瘟病菌孢子喷雾接种、水稻育苗、水稻总RNA提取、real-timeRT-PCR及数据分析等方法均与常规相同。本专利技术的有益效果是直接准确地检测经弱酸处理的稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子悬浮液喷雾接种于水稻叶片上，于不同时间点取样，提取水稻叶片总RNA，real-timeRT-PCR分析受侵染水稻PCD途径相关基因PR1a的表达。克服了已有研究病菌与寄主互作时对非生物因子响应机制时借助温室设计各种弱酸处理以观察寄主表型变化、以及筛选大量水稻防御相关基因表达等周期长和效率低的弊端，最终达到为今后有目的地直接深入开展病原菌与寄主互作时对非生物因子之一(弱酸)响应机制的研究提供重要的实验依据。具体方法是采用弱酸处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子，将处理后的孢子悬浮液喷雾接种于水稻叶片上，于不同时间点(0h,24h,48h,72h和96h)取样，提取样品总RNA，real-timeRT-PCR分析PCD途径相关的基因(PR1a和PR5)的表达量。通过分析弱酸(pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5)处理病原菌基因过表达菌株侵染水稻后对水稻PCD途径相关基因表达的影响，可准确快速地了弱酸处理稻瘟病菌后对其侵染水稻PCD途径相关基因的表达变化，为有目的地直接深入开展病原菌与寄主互作时对非生物因子之一(弱酸)响应机制的研究提供重要的实验依据。克服了已有研究病菌与寄主互作时对非生物因子响应机制时借助温室设计各种弱酸处理以观察寄主表型变化、以及筛选大量水稻防御相关基因表达等周期长和效率低的弊端。实施例一：采用弱酸pH4.6处理稻瘟病菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水稻叶片上，28℃黑暗保湿24h后，置于温室中进行保温保湿。于接种0h、24h、48h和96h取样，TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA，利用real-timeRT-PCR检测PCD途径相关的基因(PR1a和PR5)表达量(表1)。表1PAL和EDS1在pH4.6处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量实施例二：采用弱酸pH5.0处理稻瘟病菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水稻叶片上，28℃黑暗保湿24h后，置于温室中进行保温保湿。于接种0h、24h、48h和96h取样，TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA，利用real-timeRT-PCR检测PCD途径相关的基因(PR1a和PR5)表达量(表2)。表2PAL和EDS1在pH5.0处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量实施例三：采用弱酸pH5.2处理稻瘟病菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水稻叶片上，28℃黑暗保湿24h后，置于温室中进行保温保湿。于接种0h、24h、48h和96h取样，TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA，利用real-timeRT-PCR检测PCD途径相关的基因(PR1a和PR5)表达量(表3)。表3PAL和EDS1在pH5.2处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量实施例四：采用弱酸pH5.5处理稻瘟病菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水稻叶片上，28℃黑暗保湿24h后，置于温室中进行保温保湿。于接种0h、24h、48h和96h取样，TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA，利用real-timeRT-PCR检测PCD途径相关的基因(PR1a和PR5)表达量(表4)。表4PAL和EDS1在pH5.5处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量以上显示和描述了本专利技术的基本原理和主要特征及本专利技术的优点。本行业的技术人员应该了解，本专利技术不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本专利技术的原理，在不脱离本专利技术精神和范围的前提下，本专利技术还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本专利技术范围内。本专利技术要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用弱酸pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子；(2)用悬浮液喷雾接种水稻叶片；(3)于0h,24h,48h,72h和96h五个时间点取样，提取水稻样品总RNA；(4)反转录成cDNA，real‑time RT‑PCR检测cDNA；(5)分析PCD途径相关的主要基因PR1a和PR5在不同时间点的表达。

【技术特征摘要】
1.一种抑制侵染水稻PCD途径相关基因上调的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用弱酸pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子；(2)用悬浮液喷雾接种水稻叶片；(3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗琼，杨静，王春梅，刘林，王云锋，张娅玲，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53