水稻砷酸还原酶基因OsHAC4及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻具有砷酸还原活性的砷酸还原酶基因OsHAC4编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明专利技术还同时公开了编码上述蛋白的基因，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。该基因的用途是能用于降低水稻体内砷含量。

【技术实现步骤摘要】
水稻砷酸还原酶基因OsHAC4及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域。具体的说，本专利技术涉及一种图位克隆技术克隆的水稻OsHAC4基因的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白属于结构上砷酸还原酶蛋白基因，转基因实验及砷酸盐处理后植物组织砷含量测定实验鉴定该基因调控水稻体内五价砷的还原。
技术介绍
砷在自然界中广泛存在，是地壳中含量最丰富的元素之一，平均浓度接近3mg·kg-1(CullenandReimer,1989)。通常情况下，砷通过自然反应和人为作用释放到环境中，例如火山排放、岩石风化、温泉释放、采矿、冶炼以及含砷的农药、除草剂，木材防腐剂和饲料添加剂的使用等(Zhaoetal.,2010b)。目前，砷污染已然成为一个全球性的问题，主要涉及食物、空气、水体及土壤污染等方面。无机砷属于人类一级致癌物质，水体和食物为主要的砷污染来源(Smithetal.,2002；Tsujietal.,2007)。报道显示有70多个国家的地下水受到砷的污染，对全世界约1亿5千万人的身体健康产生严重的危害，这些人中大约1亿1千万人来自于亚洲的十个国家，其中孟加拉国和印度已经大规模地遭受无机砷毒害(Brammeretal.,2009；Bhattacharjee,2007)。砷污染过的地下水用于灌溉，同样会对人体产生巨大的危害。所有植物都能吸收砷，但是相对于其他作物来说，水稻从土壤中同化砷的能力是高效的(Williamsetal.,2007)。甚至在没有被砷污染过的土壤中，水稻中砷的含量也普遍很高，这可能与厌氧的环境下砷的生物利用率会提高相关(Xuetal.,2008)。由于特殊的生理结构和转运机制，砷会大量积累在稻粒中，通过食物链的作用被摄入到人体内，成为以水稻为主食的人类健康的潜在威胁(Meharg,2004；Zhuetal.,2008)。同时由于砷长期积累在被灌溉的土壤中，也会对这些地区的可持续发展造成一定影响(Maetal.,2008)。目前砷的污染问题已经得到广泛的重视，并通过一些积极措施减轻危害。研究表明合理的管理运用灌溉水和选育低砷积累的品种是两种减少砷在水稻中积累的可行性方式(Yietal.,2015)。砷的毒性强度与存在形式有关，无机砷的毒性高于有机砷，无机砷中亚砷酸盐的毒性高于砷酸盐，但是当有机砷中的五价单甲基砷酸盐(MMA)和二甲基砷酸盐(DMA)还原成三价时，毒性会显著提高(Stybloetal.,2000)。砷对动植物的危害是巨大的，浓度超过一定的范围甚至会致死。例如长期暴露在砷环境下的植物会导致光合作用受阻，生长发育受到抑制，同时也会引起谷粒的减产(JainandGadre,1997)。人体在砷中毒后可能导致皮肤、消化系统、神经系统、呼吸系统、心血管系统等疾病(Kalaetal.,2000；Maoetal.,2010)。研究表明砷酸盐会影响磷的代谢途径，导致DNA、RNA等物质的合成受阻(Hughes,2002)。亚砷酸盐会与一些功能基团如巯基(-SH)等发生亲和反应，使得某些酶和蛋白质功能丧失，最终导致细胞的代谢无法正常运行，从而产生细胞死亡(QuaghebeurandRengel,2003)，但是具体的致病机制仍不清楚。目前发现，植物对砷的吸收形态主要是无机砷，包括砷酸(盐)(AS(V))和亚砷酸(盐)(AS(III))，有机砷在土壤中含量较少，而且吸收速率较慢(Raabetal.,2007)。植物体内砷的主要形态为为无机三价砷，如印度芥菜(Brassicajuncea)根与地上部中三价砷占96-100％，拟南芥(Arabidopsisthaliana)叶片中97-100％为三价砷，水稻(Oryzasativa)和番茄(Lycopersiconesculentum)根中三价砷的比例为92-99％(Zhaoetal.,2010；Pickeringetal.,2000；Dhankheretal.,2002；Liuetal.,2010)，说明五价砷吸收后很快被还原为三价砷，大多数植物都具有较强的砷酸还原能力。研究表明，五价砷的还原主要依靠砷酸还原酶，该还原酶还原反应需要还原型谷胱甘肽(GSH)作为电子供体。在拟南芥(A.thaliana)(Dhankheretal.,2006)，绒毛草(H.lanatus)(Bleekeretal.,2006)，水稻(O.sativa)(Duanetal.,2007)和砷超富集植物蜈蚣草(Pterisvittata)(Ellisetal.,2006)等植物体内都克隆到了砷酸还原酶ACR2基因，这些基因在大肠杆菌arsC缺失突变体中表达或者在酵母acr2p缺失突变体中表达都能回复对五价砷的抗性，说明植物ACR2基因具有还原五价砷的能力。然而对拟南芥ACR2基因研究发现，拟南芥acr2突变体无论砷的还原、外溢，还是砷的积累、抗性都与野生型没有差异，暗示AtACR2基因并不在拟南芥砷代谢过程中起作用。最近，两个研究组分别通过GWAS和近等基因系QTL的方法，克隆了拟南芥的另外一个砷酸还原酶基因AtHAC1(AtATQ1)(Chaoetal.,2014；Sanchez-Bermejoetal.,2014)。HAC1在大肠杆菌arsC缺失突变体中表达也可以回复对五价砷的抗性。hac1突变体对砷的敏感性增加，根中五价砷含量大量增加，说明HAC1可能在拟南芥砷还原过程中有重要作用，起着在控制根部五价砷浓度的作用。通过拟南芥砷积累的品种Krefeld(Kr)与砷非积累的品种Collumbia之间的嫁接实验证明，根中的AtHAC1基因的突变，是导致地上部砷积累的主要原因(Chaoetal.,2014)。AtHAC1与AtARC2在蛋白序列上具有同源性，但缺失了酵母保守的HCX5R核心砷酸还原位点。在植物中，HAC1的蛋白序列具有高度保守性。研究还发现，虽然Athac1突变体中五价砷的含量增加，但是根中三价砷的含量并没有变化，说明还存在另外的砷酸还原系统，而在此途径中，GSH可能起重要作用。在大肠杆菌和酵母中，也存在这种功能冗余现象(Odenetal.,1994；Liuetal.,2012)。一种可能是依赖于GSH的缓慢的非酶促反应而导致的还原；另一种可能是以GSH作为还原剂，酶促剪切被砷酸化的底物而导致的还原(Gregusetal.,2009)。另外，拟南芥hac1arc2双突变体材料并没有上位或加性效应，暗示HAC1是参与拟南芥五价砷还原的主要还原酶(Ellisetal.,2006)。HAC1-GFP定位于根毛、表皮和中柱鞘细胞，表明其参与两个过程：1、在根表皮细胞内，砷酸盐被快速还原以外排；2、在中柱鞘细胞内，砷酸盐被快速还原并形成PCn-As络合物而被输送入液泡或直接被转运入木质部(Chaoetal.,2014)。研究还发现，HAC1可以与三价砷外溢载体结合，从而促进三价砷的外溢。对于水稻砷酸还原酶的研究有助于有助于加深对水稻砷酸盐吸收外排和耐受的分子机制的认识，可以通过基因改良减少水稻中砷的积累，对提高粮食安全具有重要意义。上文中涉及的参考文献如下：1、Bhattacharjee,Y.ASluggishResponsetoHumanity'sBiggestMas本文档来自技高网...

【技术保护点】
水稻具有砷酸还原活性的砷酸还原酶基因OsHAC4编码的蛋白质，其特征在于：具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.水稻具有砷酸还原活性的砷酸还原酶基因OsHAC4编码的蛋白质，其特征在于：具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述氨基酸序列还包括在SEQIDNO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。3.编码如权利要求1或2所述的蛋白或其功能类似物的基因，其特征在于：具有SEQIDNO：1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐纪明，王蕾，丁小萌，吴忠长，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33