本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因及其重组载体和重组假单胞菌。本发明专利技术所述异丁香酚单加氧酶操纵子基因具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或在SEQ ID NO:1所示核苷酸序列基础上依照假单胞菌的密码子偏好性优化后的核苷酸序列。本发明专利技术提供了一段异丁香酚单加氧酶操纵子基因以及依照假单胞菌密码偏好性优化后的操纵子基因，该操纵子基因通过基因工程技术应用于重组载体和重组工程菌构建中，所获得的重组假单胞菌对异丁香酚、香草醛、阿魏酸等底物或产物的耐受性较高，且应用于香兰素生产中无需添加有毒的诱导剂，香草兰收率达到70％以上，同时异丁香酚单加氧酶具备较高酶活。
【技术实现步骤摘要】
一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因及其重组载体和重组假单胞菌
本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因及其重组载体和重组假单胞菌。
技术介绍
香兰素学名3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，也称之为香草醛。目前香兰素产品的主要用途有食品添加剂、医药中间体、饲料添加剂与其它(如电镀增亮剂等)四个方面，各种用途的使用比例分别为食品添加剂接近50％、医药中间体接约20％、饲料添加剂约20％与其它用途约10％。作为食品添加剂，香兰素可广泛运用在各种需要增加奶香气息的调香食品中，如蛋糕、冷饮、巧克力、糖果、饼干、方便面、面包及各种炒货产品中。除用作食品添加剂外，作为香料产品还广泛应用于日化香精与烟用香精的调配。香兰素按原料与生产方法可以分为天然香兰素与合成香兰素二种。香兰素天然存在于香荚兰豆、秘鲁香膏油、丁香花蕾油中，天然香兰素主要来自于香荚兰豆与利用天然原料通过生物技术合成二种途经，仅在少量有特殊需要的场合使用，实际使用的香兰素主要是合成香兰素。大多数化学合成的香兰素在纯度、香气、安全性等方面都亚于天然提取的香兰素，并且化学工业废弃物对环境存在很大的危害。随着社会的发展，人们对高品质绿色健康产品的追求，对安全性要求的提高，使得天然香兰素供不应求。因此，急切需要寻找一种生产天然安全的香精香料的方法。在生物技术不断发展的今天，研究者将目光集中到如何将生物技术运用于制备天然香精香料。在过去十几年里，研究者报道以各种前体通过生物转化的方式合成香兰素，但都存在着原料成本高、反应转化效率低、反应步骤长、工艺步骤复杂，因此在工业化生产方面受到很大的限制。异丁香酚单加氧酶能够将丁香酚、异丁香酚等底物转化为香兰素，是制备生物香兰素的高效途径。但目前现有已知的天然异丁香酚单加氧酶的野生型菌株，其菌株的产酶能力较弱，远远难以满足工业生产的需要，且由于野生型菌株其安全性不可预知，在生产食品及药品用香兰素时，难以获得市场准入许可，并且增加了食品药品的安全风险。另外，目前已知的表达异丁香酚单加氧酶的基因工程重组菌株，其表达载体的宿主为大肠杆菌或者酵母菌，其对异丁香酚、阿魏酸、香兰素等芳香酚、芳香醛等有机物的耐受性能较低，导致其表达效率及酶产量较低，进而影响到香兰素的产量。此外，异丁香酚单加氧酶基因的在大肠杆菌及酵母菌种的异源表达效率较低，并且需要添加对菌体有毒且价格昂贵的诱导剂，例如IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)。另外，部分异丁香酚单加氧酶基因在大肠杆菌中表达时必需要添加Fe3+，Fe2+等金属离子伴侣，否则不具备异丁香酚单加氧酶活力。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因，使得所述基因应用于重组载体以及重组假单胞菌中后，能够提高菌株对异丁香酚、阿魏酸、香兰素等芳香酚、芳香醛等有机物的耐受性，进而提高香兰素产量，并且无需添加有毒的诱导剂即可生产；同时菌株生产的异丁香酚单加氧酶具有较高活性。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因，具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列或在SEQIDNO:1所示核苷酸序列基础上依照假单胞菌的密码子偏好性优化后的核苷酸序列。针对以酵母或大肠杆菌作为异丁香酚单加氧酶重组表达载体宿主时，其重组表达载体宿主对异丁香酚、香草醛、阿魏酸等底物或产物的耐受性能较低的问题，以及异丁香酚单加氧酶操纵子基因异源表达效率较低的问题，本专利技术提供了具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的异丁香酚单加氧酶操纵子基因，其包含了启动子、调控因子基因和异丁香酚单加氧酶编码基因，其中第1507个碱基至2943个碱基所在核酸序列为异丁香酚单加氧酶基因编码序列，第382个碱基至第1332个碱基所在核酸序列为调控因子编码基因序列。本专利技术还涉及根据假单胞菌的密码子偏好性优化的异丁香酚单加氧酶操纵子基因。所述的密码子偏好性是指菌体对简并性同义密码子的偏好使用情况。由于编码相同氨基酸的不同密码子，在不同物种、不同生物体中使用的频率并非完全地平均分布，也即绝大多数生物倾向于只利用这些密码子中的一部分，该现象也称密码子的偏好性。其中那些被最频繁利用的密码子称为最佳密码子(optimalcodons)，而那些不被经常利用的密码子称为稀有或利用率低的密码子(rareorlow-usagecodons)，采用使用频率较高的密码子可能可以提高菌体的表达效率。所述的优化方式为依据假单胞菌的密码子使用频率情况，将异丁香酚单加氧酶操纵子中的调控因子基因或者异丁香酚单加氧酶编码基因中的使用频率较低的同义密码子所对应的核苷酸三联体，替换成具有较高使用频率的同义密码子所对应的核苷酸三联体，同时保证全长基因片段CG含量基本不变(优化前后CG含量变动不超过5％，优选的不超过1％)，同时尽量减少编码基因对应mRNA中反向上重复的序列出现的次数(invertedrepetitiveseq-uence)以减少可能发卡结构(Hairpin)的数量。本专利技术中优选恶臭假单胞菌KT2440密码子偏好情况以及恶臭假单胞菌通用密码子偏好情况，分别见表1和表2所示。上述优化过程可以通过编写任一一款实现上述功能的软件实行，也可以采用公开的具有上述密码子优化功能的软件实现，(例如http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/；http://www.jcat.de/；)。在具体实施方式中，本专利技术通过在线密码子优化软件(http://www.jcat.de/)和OPTIMIZER针对异丁香酚单加氧酶编码基因进行随机优化，分别获得了13条和8条，但是经过构建重组假单胞菌验证异丁香酚单加氧酶酶活，只有其中4条优化后的基因(本专利技术SEQIDNO:2-5所示核苷酸序列的异丁香酚单加氧酶操纵子基因)构建的菌株产酶酶活得到显著提高，其他存在酶活下降或消失的现象，表明并非所有优化后的基因构建重组菌株后均可以实现提高酶活的目的。因此，作为优选，优化后的基因选自SEQIDNO:2-5任意一个所示的核苷酸序列。本专利技术所述操纵子基因通过构建重组载体，转化至菌株后能够具备较高酶活，并且对高浓度底物有较高耐受性，故本专利技术提出了所述操纵子基因在制备重组载体和/或重组假单胞菌中的应用。其中，所述的载体可为本领域常用的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选为质粒，质粒更优选为pBBR1MCS系列质粒，如pBBR1MCS-5-start质粒，所述的pBBR1MCS-5-start质粒可由商品化产品质粒pBBR1MCS根据文献SonjaFedoraGordanaImprovementofpBBR1MCSplasmids,averyusefulseriesofbroad-host-rangecloningvectors所报道的方法步骤由本领域技术人员自行构建获得。所述假单胞菌可选自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)或硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)，在本专利技术具体实施过程中可选择恶臭假单胞菌KT2440或恶臭假单胞菌MTCC5279(均购置于广东省微生物菌种保藏中心，GIMCC)。针对上述操纵本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因，其特征在于，具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或在SEQ ID NO:1所示核苷酸序列基础上依照假单胞菌的密码子偏好性优化后的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因，其特征在于，具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列或在SEQIDNO:1所示核苷酸序列基础上依照假单胞菌的密码子偏好性优化后的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述操纵子基因，其特征在于，所述在SEQIDNO:1所示核苷酸序列基础上依照假单胞菌的密码子偏好性优化后的核苷酸序列选自SEQIDNO:2-5任意一个所示的核苷酸序列。3.权利要求1或2所述操纵子基因在制备重组载体和/或重组假单胞菌中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述质粒为pBBR1MCS质粒。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述pBBR1MCS质粒为pBBR1MCS-5-start质粒。7.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)或硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌KT2440或恶臭假单胞菌MTCC5279。9.一种重组质粒，其特征在于，包括基础质粒和位于基础质粒上的权利要求1或2所述操纵子基因。10.根据权利要求9所述重组质粒，其特征在于，所述基础质粒为pBBR1MCS质粒。11.根据权利要求10所述重组质粒，其特征在于，所述pBBR1MCS质粒为pBBR1MCS-5-start质粒。12.权利要求9-11任意一项所述重组质粒在制备重组假单胞菌中的应用。13.根据权利要求12所述应用，其特征在于，所述假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)或硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)。14.根据权利要求13所述应用，其特征在于，所述恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌KT2440或恶臭假单胞菌MTCC5279。15.一种重组假单胞菌，其特征在于，转化有权利要求9-11任意一项所述重组质粒。16.根据权利要求15所述重组假单胞菌，其特征在于，所述重组假单胞菌为重组铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、重组恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)或重组硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)。17.根据权利要求16所述重组假单胞菌，其特征在于，所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌KT2440或重组恶臭假单胞菌MTCC5279。18.权利要求15-17任意一项所述重组假单胞菌在制备催化异丁...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢磊，李慧芝，祝海霞，张鹏，李斌，
申请(专利权)人：波顿上海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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