一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法，该方法是指先从大豆根中提取总RNA，通过RT-PCR获得总mRNA的cDNA，用sbp基因特征引物，PCR扩增获得sbp基因并测定其序列；其次用连续易错PCR的方法突变sbp基因，构建出sbp基因随机突变文库；最后将此突变基因在Pichiapastoris表达系统中分泌型表达SBP，采用微孔板筛选法筛选出高效表达SBP的基因工程菌。本发明专利技术具有生产大豆过氧化物酶成本低、表达量高、筛选速度快的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及。
技术介绍
大豆过氧化物酶(SBP)与辣根过氧化物酶同属于以血红素为辅基的III类过氧化物酶(EC1. 11. 117)，结构和功能非常相似。目前辣根过氧化物酶已经作为一种商品化试剂广泛用于免疫测定技术、电镜技术、酶联反应和免疫印迹等生物学研究，同时在生物传感器、木素降解、工业“三废”处理等方面也有应用，所以大豆过氧化物酶同样有着广泛的应用前景。同时大豆过氧化物酶所具有的底物作用范围广、耐热性能高、酸碱稳定性好、PH适用范围宽等优点是辣根过氧化物酶不可比拟的，所以大豆过氧化物酶很可能会成为辣根过氧化物酶一个最有竞争力的替代品，成为过氧化物酶的一个很好的来源。对大豆过氧化物酶的研究可以追溯到1981年DvadiJ. Sesas和Robert LAndero的纯化和简单性质的研究。但直到上世纪九十年代中期开始，人们对SBP的研究才逐渐重视起来。1997年美国的Ameriena Qualex和Enzymol International公司将SBP应用于医药诊断试剂盒生产，用于诊断病毒、细菌、寄生所引起的疾病，包括AIDS和疟疾。SBP-试剂盒的性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：⑴野生型sbp基因的克隆与检测：从大豆根中提取总RNA，通过RT?PCR获得的cDNA，用设计的sbp基因特征引物进行PCR扩增获得野生型sbp基因，经质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段；⑵pPICZa?A?sbp重组表达载体的构建及鉴定：用限制性内切酶Xho1和XbaI按双酶切法将所述野生型sbp基因连接到pPICZa?A质粒中，构建重组表达载体pPICZa?A?sbp；再用CaCl2法将所述pPICZa?A?sbp转化至大肠杆菌E.coli?DH5a，最后筛选阳性克隆体并对该阳性克隆体进行测序；⑶野生型sbp基因...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王黎，曾家豫，廖世奇，袁红霞，毛爱红，马瑾，田彩平，魏政丽，
申请(专利权)人：甘肃省医学科学研究院，
类型：发明
国别省市：