中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法技术

本发明专利技术公开了了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法，其步骤为中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达载体的构建和中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达；本发明专利技术成功表达了MIH蛋白，为进一步了解早熟蟹性腺提早发育的内在机理，了解蟹类蜕皮腺的功能机制并为进一步制定控制河蟹性早熟的技术措施提供理论基础，获得实现生长发育和繁殖的人工调控的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因的表达方法，特别涉及到中华绒螯蟹蜕皮抑制激素I基因的真核表达方法。
技术介绍
脱皮是甲壳动物生长和发育的标志特征，它贯穿甲壳动物个体发育的始终，它受神经系统和内分泌系统共同调节。这个调节过程表现为两种互为拮抗的激素作用。蜕皮激素的刺激作用和M IH的抑制作用。蟹类眼柄中所产生的MIH含量极微，并且家族其它神经肽在大小以及一级结构上的相似性限制了直接从动物体内分离并纯化MIH蛋白。因此，常常用原核及真核蛋白表达系统来生产较大量的重组MIH(Yodmuang et al. , 2004 ；Lee and Watson, 2002 ；0hira et al.，1999 ;Sun，1997)。宋霞等(2003,2004)先后报道了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因Ers-MHII的部分cDNA序列及基因组DNA全序列(GeBnank检索号 AY310313)。Ers-MIHI成熟肽包括75个氨基酸，相对分子质量(M) r约为7. 8kD，属于小分子多肽。本实验室的郭豫杰和姚燕曾将Ers-MIHI基因成熟肽的cDNA片段连接到原核表达载体PGEX-4T-1载体和pET-28a(+)本文档来自技高网...

【技术保护点】
中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达方法，其步骤包括为：步骤一：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的真核表达载体的构建：(1)引物的设计，根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因的成熟肽编码区cDNA序列和质粒pPIC9的多克隆位点设计一对PCR引物，其中上游引物包含1个Xho?I、l个KEX2蛋白酶识别位点和MIH基因的前15个核苷酸序列，箭头位置为酵母α因子信号肽的切割位点，下游引物包含MIH基因编码区的最后15个核苷酸序列、1个6?His编码区段、1个Not?I识别位点及一个翻译终止密码子；(2)PCR反应；(3)TA克隆；(4)质粒提取；(5)酶切连接转化；(6)阳性克隆的鉴定，用PIC?MIH?...

【技术特征摘要】
1 .中华绒螯蟹蜕皮抑制激素I基因的真核表达方法，其步骤包括为 步骤ー中华绒螯蟹蜕皮抑制激素I基因的真核表达载体的构建 (1)引物的设计，根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素I基因的成熟肽编码区CDNA序列和质粒pPIC9的多克隆位点设计ー对PCR引物， 其中上游引物包含I个Xho 1、1个KEX2蛋白酶识别位点和MIH基因的前15个核苷酸序列，箭头位置为酵母α因子信号肽的切割位点，下游引物包含MIH基因编码区的最后15个核苷酸序列、I个6-His编码区段、I个Not I识别位点及一个翻译終止密码子；(2)PCR 反应；(3)TA克隆； (4)质粒提取； (5)酶切连接转化； (6)阳性克隆的鉴定，用PIC-MIH-L和PIC-MIH-R进行菌落PCR筛选阳性克隆； (7)重组质粒的鉴定，PCR产物电泳出现阳性条带的克隆按照I:100的比例稀释扩増，抽提质粒，按照引物设计的酶切位点做Xho I和Not I双酶切鉴定；挑选双酶切能出现阳性条带的克隆，并送测序验证，阳性菌落置于_20°C保种备用； 步骤ニ 中华绒螯蟹蜕皮抑制激素I基因的真核表达 (1)贮存液的配制； (2)培养基的配制； (3)菌种的复苏，把已经鉴定为含阳性克隆重组质粒PPIC9-MIH1的保种克隆菌JM109及空载体PPIC9的保种菌株DH5 α按照I :100转入新的含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养液中37°C恒温，22orpm摇床过夜； (4)质粒的提取，把过夜培养的菌液IOOOg离心5min收集细胞，用miniBESTPlasmidPurification kit试剂盒抽提重组质粒pPIC9_MIHl和pPIC9，_20°C保存备用，取2 μ I质粒用1%琼脂糖凝胶电泳检测； (5)重组质粒pPIC9-MIHl和pPIC9的线性化，用限制性内切酶BglI分别对质粒PPIC9-MIH1和pPIC9进行单酶切反应，使其线性化，酶切反应体系为10XBuffer D10 μ 1，BglII I μ 1，质粒40 μ 1，补双蒸水至100 μ 1，37°C水浴反应2小时，酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，同时用未酶切的质粒PPIC9-MIH1和pPIC9做对照，将已经线性化的pPIC9-MIHl和pPIC9用1%的琼脂糖凝胶电泳后，分别用凝胶回收试剂盒回收纯化； (6)酵母感受态细胞的制备； (7)MIHl基因的电转化； (8)酵母转化菌的鉴定； (9)MIHl表达阳性克隆的筛选； (10)最佳诱导时间的确定，取BMGY/BMMY培养基诱导的ー株重组酵母菌不同时段所取的诱导菌液I. 5ml, 40C，12000rpm离心lOmin，上清液用O. 75g硫酸铵沉淀，去上清液后，将沉淀与30 μ I SDS样品缓冲液混合，100°C煮沸5min,各取20 μ I上样，Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色显带后，用凝胶成像系统分析，以确定最佳诱导时间； (11)筛选菌株的SDS-PAGE检测； (12)重组MIHl的大規模诱导表达，步骤包括接种GS115/pPIC9-MIHl表达阳性克隆菌于IOml BMGY培养基中，30°C，250rpm摇床振荡...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷文莉，戴建华，周开亚，
申请(专利权)人：殷文莉，
类型：发明
国别省市：