本发明专利技术公开一种基因工程杂合抗菌肽CecA-Temporin-SHF生产方法，包括下列步骤，S1：杂合肽CecA-Temporin-SHF基因合成；S2：杂合肽CecA-Temporin-SHF重组酵母表达载体的构建；S3：pPIC9K-CTS表达载体的转化；S4：重组Pichia?pastoris的诱导表达。本杂合抗菌肽CecA-Temporin-SHF的生产方法工艺简单、产量高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术制药工业中基因工程生产蛋白药物领域，尤其涉及一种杂合抗菌肽CecA-Temporin-SHF(CTS)的生产方法。
技术介绍
目前养殖业中，由于抗生素泛滥使用，破坏动物肠道微生物菌群平衡，致使潜伏在体内的有害菌群大量繁殖会引起内源感染，并且还导致耐药微生物产生，致使药物剂量加大、治疗周期延长、死亡率增高等问题，而且细菌的耐药性还会向人类的转移，给人类的健康造成巨大影响。抗菌肽被认为是新一代抗生素的理想替代者。抗菌肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性的小分子多肽，存在于多种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分，具有广谱抗菌、无耐药性及毒副作用等优点。随着研究的不断深入，越来越显示出了其在医学、兽医学等相关领域的独特应用价值。杂合抗菌肽CTS具有抗革兰·氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌的能力，对耐药细菌同样具有较好抑制效果，同时具有良好热稳定性和耐酸碱能力，这些特点使得杂合抗菌肽CTS在动物疾病防治和饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。通过基因工程手段解决杂合抗菌肽CTS产量问题，减低抗生素使用量，为绿色养殖保驾护航。目前杂合抗菌肽CTS合成工艺复杂，获取量少，无法满足市场需求，提高杂合抗菌肽CTS产量是一个急需解决的问题。
技术实现思路
鉴于上述状况，有必要提供一种工艺简单、产量高的杂合抗菌肽CTS的生产方法。一种杂合抗菌肽CTS的生产方法，包括下列步骤，杂合妝CecA-Temporin-SHF 基因合成；根据GENBANK 成熟肽段 CecropinA 以(1-8)及 Temporin-SHF(1-8)的氨基酸序列(KWKLFKKIFFFLSRIF)，选用酵母偏爱密码子设计CecA-Temporin-SHF(CTS)杂合肽基因，人工合成优化的CecA-Temporin-SHF杂合抗菌肽基因，CecA-Temporin-SHF杂合肽基因5’和3’端分别引入Eco RI> Not I内切酶位点；另合成一对引物Pl与P2，其中，Pl与P2的序列分别为P1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC, P2 :GCGGCCGCTCATTGGAAGATTC，该引物 Pl 与P2用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，Pl位于毕赤酵母5’ AOX基因区，P2位于插入片段CecA-Temporin-SHF基因区，引物P1、P2的扩增长度分别为441bp ；杂合肽CecA-Temporin-SHF重组酵母表达载体的构建；PCR产物和pPIC9K均用Eco RI、Not I双酶切，T4DNA连接酶连接，连接产物转化E. coli DH5a，重组表达质粒进行PCR、缺失酶切位点鉴定，PCR以及酶切鉴定为阳性的质粒测序，构建正确的重组表达质粒命名为PPIC9K-CTS ；pPIC9K-CTS表达载体的转化；感受态Pichia pastorisGS 115 (his/Mut+)与 SacI 线性化 pPIC9K_CTS (5ug)相混合，转移至预冷的O. 2cm电转杯中，置冰上5min，1.5kV、25uF、200Q电击，立即加ImL预冷的lmol/L山梨醇，取200uL涂布于含G418(5. Og/L)的YPD平板上筛选转化子，30°C孵化4 5d至平板出现乳白色的酵母转化菌落；采用PCR方法分析Pichia pastoris转化子，用煮-冻-煮法制备PCR模板，以Pl，P2为引物，PCR反应条件-MV 5min ；94°C 45s,61。。45s, 72°C 45s，25个循环；72°C 5min。以能扩增出441bp的克隆定为阳性转化子；重组Pichia pastoris的诱导表达；将筛选到的阳性酵母菌接种到5mL BMGY中，30°C、230r/min振荡培养约22h至0D600达到3-6 ;室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mL BMMY培养基，进行诱导表达；28°C、250r/min培养60h，期间每24h补加终浓度为1% (V/V)的甲醇；72h后5000r/min离心IOmin ;收集培养液上清，即获得杂合肽CecA-Temporin-SHF蛋白，分子量2. IKD,具有明显抑菌活性。本专利技术采用pPIC9K/Pichia pastoris GSl 15系统，构建高效表达杂合抗菌肽CTS 基因工程菌株，大量获得杂合抗菌肽CTS，为健康养殖、食品安全提供强有力的保障。附图说明图I是以重组质粒pPIC9K-CTS为模板，用P1、P2引物进行PCR扩增目的基因片段，所得电泳图谱；图2是重组质粒pPIC9K-CTS的酶切分析图；图3是重组菌株的PCR分析图；图4是表达蛋白SDS-PAGE电泳图谱；图5是抑菌试验对照图。具体实施例方式本专利技术公开一种杂合抗菌肽CTS的生产方法，其详细过程如下。杂合抗菌肽CTS序列的优化；外源基因的内在特性如密码子偏好性是影响外源蛋白的有效表达重要因素。根据毕赤酵母密码子偏好性，将杂合抗菌肽CTS基因的酵母低频密码子优化成高频密码子，以提高目的蛋白的翻译速度和表达量。杂合抗菌肽CTS基因优化情况如下GAATTCAAAAGAAAGTGGAAGTTGTTCAAGAAGATCTTCTTCTTCTTGTCTAGAATCTTCCAATGAGCGGCCGC通过软件分析，在基因序列的5’端和3’端分别加上EcoR I、Not I两个酶切位点。杂合抗菌肽CTS基因序列的合成合成杂合抗菌肽CTS基因序列由人工完成。合成的杂合抗菌肽CTS基因全序列为GAATTCAAAAGAAAGTGGAAGTTGTTCAAGAAGATCTTCTTCTTCTTGTCTAGAATCTTCCAATGAGCGGCCGC毕赤酵母表达载体的构建设计引物根据新合成的序列设计上下游引物Pl，P2，新合成的引物序列如下Pl (5' AOXI) GACTGGTTCCAATTGACAAGC ；P2 GCGGCCGCTCATTGGAAGATTC杂合抗菌肽CTS基因的克隆首先以合成杂合抗菌肽CTS基因为模板，用Pl，P2引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下权利要求1.，包括下列步骤， 51:杂合妝CecA-Temporin-SHF基因合成； 52:杂合肽CecA-Temporin-SHF重组酵母表达载体的构建； 53pPIC9K-CTS表达载体的转化； 54:重组Pichia pastoris的诱导表达。2.如权利要求I所述的其中所述SI过程中包括根据GENBANK成熟肽段CecropinA以及Temporin-SHF的氨基酸序列，其序列号KWKLFKKIFFFLSRIF，选用酵母偏爱密码子设计CecA-Temporin-SHF杂合肽基因，人工合成优化的CecA-Temporin-SHF杂合抗菌肽基因,CecA-Temporin-SHF杂合肽基因5’和3’端分别引入Eco RI> Not I内切酶位点；另合成一对引物Pl与P2，其中，Pl与P2的序列分别为P1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC, P2 GCGGCCGCTCATTGGAAGATTC,该引物 Pl 与P2用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，Pl位于毕赤酵母5’ AOX基因区，P2位于插入片段Cec本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因工程杂合抗菌肽CecA?Temporin?SHF生产方法，包括下列步骤，S1：杂合肽CecA?Temporin?SHF基因合成；S2：杂合肽CecA?Temporin?SHF重组酵母表达载体的构建；S3：pPIC9K?CTS表达载体的转化；S4：重组Pichia?pastoris的诱导表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙同毅，张大伟，王希辉，
申请(专利权)人：青岛根源生物技术集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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