多肽药物的高效基因工程生产方法技术

本发明专利技术用真核或原核细胞表达低分子量多肽活性物质。在核酸水平上，利用ＤＮＡ限制性内切酶中的同尾酶具有识别水解不同ＤＮＡ序列，但产生相同的粘性末端，且当二者的粘性末端连接后，该位点不再被同尾酶识别的特性，将编码目标肽段的ＤＮＡ分子串联重复，构成多聚体，并根据目标肽段的氨基酸组成及序列特点，在各ＤＮＡ单体分子间插入适当的核苷酸序列，这些特定的核苷酸序列在翻译为氨基酸后，成为使串联重复目标肽段的多聚体断裂为单体的加工位点。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用真核或原核细胞表达小肽或低分子量多肽(肽链长度小于50个氨基酸残基)生物活性物质的基因工程生产方法。包括Leptin(瘦素)片段(Leptin 22-56)、Systemin、生长激素释放因子GRF(1-40)、粘连蛋白片段(Fibronectin 1954-1959)、赖氨酸胸腺因子(Lys-Thymic Factor)、干细胞去肉芽肽(Mast Cell Degranalating Peptide)、胸腺肽α1(Thymosin α1)、生长激素释放因子片段(1-29)(GRF 1-29)、血管生成素片段(Angiogenin 108-123)、血管生成素片段(Angiogenin 108-122)、神经肽Y(Neuropeptide Y)、Vasonatrin肽(VNP)、生长激素释放因子GRF(1-44)、神经肽Y片段(Neuropeptide Y 2-36)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、酪氨酸型—促肾上腺皮质激素释放因子(Tyr-CRF)、Thymopoietin II片段(29-41)、纤维蛋白原结合抑制肽、β10胸腺肽(Thymosin β10)、粘附抑制肽(I)、Tritrpticin、Leptin片段(116-130)、RGD肽III、β-胸腺肽片段(16-38)(Thymosin 16-38)、Cecropin A、CD36(93-110)cys、缓激肽增效剂C(Bradykinin Potentiator C)、缓激肽增效剂B(Bradykinin Potentiator B)、胸腺化学激活素(Thymus and Activation Regulated Chemokine)、RGD肽II、BPP 9a、Defensin HNP-I、Backenecin、HIV(gp 120)片段(315-329)、血管紧张肽原酶抑制剂、成纤维细胞生长因子片段(FGF basic 119-126)、Parasin I、肿瘤坏死因子α片段(159-178)、WP9QY、尿胰蛋白酶抑制剂片段(Urinary Trypsin In-hibitor Fragment)、吗啡调节神经肽I、神经肽Y片段(22-36)(Neuropeptide Y22-36)、吗啡调节神经肽II、Neuropeptide FF(NpFF)、α-海葵毒素GI(α-Cono-toxin GI)、Defensin HNP-1、HIV(gp 120)片段(308-331)、细胞间粘附因子片段(1-23)(Intercellular Adhesion Molecular 1-23)、Tachyplesin I、Polyphemusin II衍生肽(Polyphemusin II-Derived Peptide)、内毒素抑制剂(EndotoxinInhibitor)、α-海葵毒素MI(α-Conotoxin MI)、蛙皮抗菌肽I(magainin I)、蛙皮抗菌肽II(Magainin II)、神经肽Y片段(22-36)(Neuropeptide Y 22-36)、肝素结合肽(I)、成纤维细胞生长因子受体结合抑制肽、粘连蛋白吸附促进肽(FibronectinAdhesion Promoting Peptide)、促肾上腺皮质激素片段ACTH(1-24)、CecropinB、促肾上腺皮质激素ACTH(1-17)、CDR-H31C2、血管紧张素转化酶抑制肽(金枪鱼)、C型促尿钠排泄肽(C-Type Natriuretic Peptide 32-53)、Tachyplesin I、凝血酶受体模拟肽、黄体激素释放激素(LHRH)、C—反应蛋白片段(174-185)(C-Reactive Protein 174-185)、血管紧张素III(Angiotensin III)、血管紧张素II(An-giotensin II)、β-白细胞介素前体蛋白片段(110-123)、糖蛋白II b片段300-312(Glycoprotein II b Fragment 300-312)、RGD肽、RGD环肽I、粘连蛋白片段1978-1982(Fibronectin cs-1 Fragment1978-1982)、粘连蛋白片段(1978-1985)(Fi-bronectin cs-1 Fragment 1978-1985)、糖蛋白II b片段(296-306)(Glycoprotein IIb Fragment 296-306)、心房促尿钠排泄因子(1-28)(Atrial Natriuretic Factor1-28)、水蛭肽Hirullin、粘连蛋白片段(196-203)(Fibronectin Fragment 196-203)、海葵毒素α-Conotoxin IMI、HIV(gp 120)片段(315-329)、HIV(gp41)片段、促红细胞生成模拟肽(Erythropoietin Mimetic Peptide Sequence 20)、Laminin片段、β-淀粉样蛋白片段(25-35)、细胞肿瘤抗原P53片段(361-382)、α1-胸腺肽。尤其是人B-型促尿钠排泄肽(BNP)的制备、人α1-胸腺肽的制备、gp120片段315-329的制备、C反应蛋白片段174-185的制备、血管加压素转化酶抑制肽的制备。目前，用基因工程生产低分子量多肽的常用方法是将单个目标肽段分子的核酸序列与载体蛋白基因连接，首先表达融合蛋白，再用酶解法使目标肽段分子从融合蛋白中释放出来。其缺点是采用融合蛋白方法表达的目标肽段成份在融合蛋白中仅占10％左右，效率低，生产成本较高。另一种生产低分子量多肽的常用方法是化学合成法，其缺点是生产过程涉及对功能基因的保护和去保护，而且某些氨基酸合成掺入的效率较低，因此当合成的多肽分子的片段较长时，往往产率较低。此外，化学合成法所用的原材料对环境有害，此微的掺入影响终产品的纯度。本专利技术的目的就是为了解决上述问题，提出一种可提高目标多肽的产量且生产成本低的。本专利技术的技术解决方案一种，其特征在于它在DNA水平上，将目标肽段的DNA序列串联为多聚体，并用原核或真核细胞表达小肽或低分子量多肽的串联重复多聚体。本专利技术通过将目标肽段分子的基因序列重复串联为多聚体，用原核或真核细胞表达，并用酶学或化学方法将目标肽段的多聚体断裂加工为目标肽段单体，该方法能够使表达产物几乎全为目标肽段成分，同时，本专利技术可以有效表达5-50个氨基酸长度的目标肽段，因此，生产成本较低。本专利技术首先用化学合成目标肽段的单体(对多肽而言)或多体(对小肽而言)核苷酸序列，这使我们可以针对表达的宿主(真核或原核细胞)，选择其优先使用的密码子，从而使产物的表达效率进一步提高。本专利技术可以在目标肽段的串联重复基因序列的5′端或3′端插入适当的核苷酸序列，使得表达的目标肽段多聚体能够进行亲和层析(如携带抗原序列或组氨酸6聚体)，从而使多肽聚合体在加工断裂前得到高效纯化。本专利技术利用同尾酶的特性，可以很方便地使目标肽段单体分子定向克隆为多聚体，且多聚体的聚合度可以随意选择(2，3，4，5…体)。目前已经发现核酸限制性内切酶中存在近百对同尾酶(见附表I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽药物的高效基因工程生产方法，其特征在于它在ＤＮＡ水平上，将目标肽段的ＤＮＡ序列串联为多聚体，并用原核或真核细胞表达小肽或低分子量多肽的串联重复多聚体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙自勇，刘建宁，
申请(专利权)人：刘建宁，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]