家蚕生产基因工程生白细胞药物的方法技术

本发明专利技术属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽类药物的技术领域，利用家蚕幼虫、蛹及蛾作为生物反应器，通过基因工程技术获得带有人的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）基因的重组杆状病毒，使ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在蚕体中高效表达，经过纯化、滤去病毒、－２０℃冷冻干燥后，以家蚕血液和蛹或蛾为填充料配成口服药物的方法和技术。首次实现ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的口服药物的发明专利技术。该方法原料易得，生产成本低，疗效明显，实施价值重大。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽类药物
细胞集落刺激因子是一群对造血细胞的存活、繁殖和分化所必需的糖蛋白，hGM-CSF(human granulocyte macrophage colony stimulating factor)是其中的主要一种，它刺激颗粒细胞和集落细胞的生长。在临床上对艾滋病、先天性骨髓衰竭、白血病、骨髓移植等患者的恢复均有治疗和辅助治疗的效果。hGM-CSF更能有力地支持癌症患者进行强力化疗，促进骨髓从因化疗导致的抑制状态中迅速恢复。由于hGM-CSF在医学上的广泛用途，自80年代中期以来对hGM-CSF进行克隆化基因进行表达，以期获得大量的rhGM-CSF用以制备药物，成为世界各国关注的热点。据检索，1985年Wong等采用猴COS细胞系统进行了表达(Science 228:810-815)，虽然其产量比人体正常T细胞表达要高约30倍，但表达量仅约1毫克/L倍基左右。Miyajia(1986,EMBO-J 5:1193)和Shaw(1988 DNA 7(2):117)等使用酵母分泌表达系统分泌表达了人和鼠的GM-CSF，表达的GM-CSF存在有酵母特异的碳水化合物分枝，且表达量亦不高。大肠杆菌融合表达系统是目前国内外大多数研究机构和企业采用的工艺并已有产品问世，但是采用该工艺的关键限制因素在于形成包涵体，蛋白质变性和复性以及后处理工艺的繁琐操作，使其生产成本高，且药物仅限于注射剂。本专利技术的目的是提供一种用家蚕幼虫、蛹、蛾为生物反应器，高效表达rhGM-CSF，所获得的重组hGM-CSF以蚕及蛹作为主要药用填料，制成口服药物，在鼠、猕猴体中的实验证明其有明确药效。本专利技术降低了生产成本，蚕幼虫和蛹表达rhGM-CSF适合大规模生产rhGM-CSF并制成口服药物。打破了活性蛋白质不能被肠道吸收产生作用的传统理论。本专利技术所述的家蚕生产rhGM-CSF口服药物的方法是通过将hGM-CSF基因进行点突变，在其两端加上一个与载体相配的酶切位点，使之与家蚕杆状病毒载体连接后与野生型家蚕杆状病毒在家蚕细胞中重组，通过空斑筛选，获得重组的带有hGM-CSF基因的家蚕杆状病毒，通过人工接种家蚕幼虫、蛹、蛾，使之发病并经5-7天饲养后，收集家蚕幼虫体液和蛹体或，蛾，经匀浆、过滤离心分离去杂质后，冷冻干燥，在无菌条件下装入胶囊实现的。下面结合实施例详细阐述本专利技术的具体内容1、为了从pCK-hGM-CSF(为本专利技术申请人构建保存)中克隆出hGM-CSF，在基因5′端起始密码子上游和3′端终止密码子下游设计了如下PCR引物，并经PCR扩增获得突变的hGM-CSF基因。引物1:5′-TCTCTAGAGGATGTGGCTGGCTGCAG-3′,引物2:5′-GTTTCTGGATCTTGTTTCAT-3＇。PCR参数设计如下变性92℃,1min；复性50℃,1min；延伸72℃,1min,35个循环。试验所用的PCR Kit购自德国宝灵曼公司，操作方法如下(1)一个小离心管中(0.5ml)，混合以下成分10x缓冲液 10μl4种dNTPs混合液(每种1.25mM)16μl引物1(2μl) 30pmoles引物2(2μl) 30pmoles模板DNA(0.1-0.2μg)加双蒸水至100μl(2)将反应混合物，放置于94℃水浴变性模板DNA 5分钟。(3)加0.5μl Taq DNA聚合酶。(4)加100μl石蜡油于反应试管中，防止样品水份的蒸发。(5)将反应放入PCR仪中，按上述PCR参数条件设计35个循环。(6)反应完成后，从反应液中取10μl走电泳以鉴定扩增片段。因在pCD-hGM-CSF质粒中基因的5′端和3′端均缺少可直接利用的酶切位点，加上hGM-CSF基因两端的非编码区序列也不符合杆状病毒载体高表达的要求，必须删除。设计用的PCR引物既引入合适的酶切位点，同时也删去了不必要的片段，达到了改建的目的。2、用XhoⅠ从pCD-hGM-CSF中切出1.4kb片段，以此为模板进行上述PCR反应，扩增出长度为510bp的片段。反应产物用XbaⅠ酶切后，克隆进pUC18(宝灵曼公司产品)的XbaⅠ位点，经连接后，转化大肠杆菌TG1(Promega公司产品)菌株，用PstⅠ鉴定重组子，切出约510bp片段，表明克隆方向正确，获得重组子pU-CSF，对pU-CSF进行序列分析，表明PCR改建已达到目的，经序列分析(操作方法详见分子克隆第13章，科学出版社，1995)，该质粒的hGM-CSF结构基因的序列与原始序列完全相同。转化是将外源DNA分子引入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法，它是微生物遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。本实验以E.coli TG1菌株为受体细胞，用CaCl2处理使受体菌处于感受状态。本实验用的pUC18质粒。它带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr和lacZ基因)。可能过Amp抗性和α互补两种特征来筛选转化子。(1)试剂①E.coli TG1菌株②pUC18质粒DNA宝灵曼公司产品。③LB培养基固体和液体培养基。④氨苄青霉素母液100mg/ml。⑤含Amp的LB固体培养基100μg/ml。⑥含X-gal和IPTG的筛选培养基；X-gal储液48mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺，配制成48mg/ml储液，包黑纸，存于-20℃备用。IPTG储液96mg IPTG溶于1ml的灭菌重蒸水中，配成96mg/ml液，储存于-20℃备用。在100ml LB固体培养基中50℃时加50μl X-gal储液和50μl IPTG储液，混匀，37℃放置4-7小时，使液体完全被吸收。4℃保存备用。X-gal是5-溴-4氯-3-吲噌-β-α-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)，它经半乳糖苷酶(β-galactosidase)水解后生成的吲噌衍生物而显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside)，为非生理的诱导物，它可以诱导LacZ的表达。⑦75mM CaCl2溶液(2)受体菌的培养从LB平板上挑取新的活化后的E.coli TG1单菌落，接种于5ml LB液体培养基中37℃下振荡培养12小时左右，取1ml培养液转入5或100ml LB中，37℃振荡培养2-3小时至对数生长期OD600c=0.5左右。(3)感受态细胞的制备①将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟。②置于4℃,5000rpm离心10分钟，倒尽上清。③用预冷的75mM的CaCl2溶液少许轻轻悬乳细胞，加一半菌液体积的CaCl2，冰上放置30分钟。④4℃,3000rpm离心10分钟，弃去上清。⑤加入200μl(5ml体积培养)或1ml(100ml体积培养)预冷的75mM的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置4小时，即成感受态细胞悬液。⑥将以上感受态细胞按200μl分装成小份，放冰上。新鲜的感受态细胞在4-24小时之内可直接用于转化。3、用BamHⅠ和HindⅡ在37℃水浴温度作用下从质粒pU-CSF中切出长约510bp的hGM-CSF结构基因片段，该片段与pBM030(Maeda,Nat本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用蚕幼虫和蛹及蛾生产重组人的粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）口服药物的方法，其特征在于应用家蚕幼虫、蛹和蛾为生物反应器，通过基因工程技术获得带有人的粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）基因的重组杆状病毒，感染家蚕幼虫、蛹及蛾，使ｈＧＭ－ＣＳＦ基因得以高效表达，并经过分离纯化，去病毒及冷冻干燥后，以家蚕幼虫血液或蛹为填充料制备基因工程药物或者纯化后直接制备药物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，吴祥甫，沈锦清，张志芳，史锋，
申请(专利权)人：浙江农业大学，中国科学院上海生物化学研究所，浙江海宁丝绸集团有限责任公司，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]