丝状真菌宿主菌株和DNA构建体以及它们的使用方法技术

本发明专利技术涉及丝状真菌宿主菌株和用于其产生和使用的重组DNA构建体。所述丝状真菌宿主菌株特别可用于实现重组酶和变体的可靠表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】丝状真菌宿主菌株和DNA构建体以及它们的使用方法相关专利申请的交叉引用本专利申请要求于2010年6月3日提交的美国临时申请61/351,286的优先权，所述美国临时申请的公开内容以引用方式并入本文。
本专利技术涉及丝状真菌宿主菌株和用于其产生和使用的重组DNA构建体。丝状真菌宿主菌株特别可用于以可靠或较不可变的方式表达目的蛋白质，且用于有效筛选编码重组蛋白的DNA文库。
技术介绍
丝状真菌宿主细胞菌株已被工程改造为表达各种蛋白质。随后，任选在纯化后，这些蛋白质可以用于各种工业、学术或其他应用中。表达过程通常会是无法预测的。仅极少数(如果有的话)所制备的转化体实际上产生目的酶，这并非罕见情况。异源基因(例如非天然基因，或以与天然形式不同的形式存在的天然基因)的表达的可变性可由于与其核酸和/或氨基酸序列无关的因素而出现。例如，非同源整合在丝状真菌中占优势。因此，表达载体随机整合到基因组内，可能导致对转化体间表达水平的位置效应。此外，可能生成不稳定转化体，使得有必要对转化体进行进一步筛选，以获得稳定转化体。可变性还可通过由于多核原生质体的转化所导致的异核体的生成而出现。因此，以减低的可变性生产目的酶的可靠方法具有明确优点。对于某些工业应用，由真菌宿主菌株生产的这些蛋白质通常被工程改造的，以获得新的期望特征或不同水平的某些特征。在这些情况下，通常使用现有丝状真菌宿主细胞菌株来筛选编码变体蛋白质的DNA文库。表达效力和/或水平的可变性使得难以将给定变体的特征与另一变体的特征进行比较。因此，如果变体可以被可靠地表达(如果它们可以由特定宿主细胞表达的话)，并且如果变体可以以较不可变的水平表达而使得它们的特征可以更容易地评估和比较，则明确存在特定的优点。虽然端粒的、染色体外的复制载体可以用作基因组整合的替代物，但这种方法并不消除转化体之间的表达水平的可变性。因此，若有手段来减少丝状真菌宿主菌株基因表达中的序列依赖性差异，将给本领域带来好处。
技术实现思路
本专利技术涉及丝状真菌宿主菌株和用于其产生和使用的重组DNA构建体。丝状真菌宿主菌株能可靠地产生转化体且表达酶，其中表达水平的可变性减低。丝状真菌宿主菌株可用于有效筛选编码重组蛋白的DNA文库。特别地，本专利技术提供丝状真菌宿主细胞表达系统，其包含：a)真菌宿主细胞，所述真菌宿主细胞在其染色体DNA中含有非同源重组(NHR)途径的一个或多个组分的破坏、缺乏第一可选择功能的第一可选择标记的部分、和可有效赋予第二可选择功能的第二可选择标记；和b)核酸分子，所述核酸分子含有当被引入该真菌宿主细胞中时给该第一可选择标记赋予第一可选择功能的序列、可有效表达一种或多种目的基因或变体目的基因的序列、和与侧接染色体可选择标记的序列具有实质同源性的序列；其中所述同源序列引起同源重组事件，所述同源重组事件导致有功能的第一可选择标记、导致第二可选择标记的去除和导致目的基因或变体目的基因的表达。在一些实施方案中，NHR途径的一个或多个组分包括ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4和xrs2中的一者或多者。在某些实施方案中，在b)中引入真菌宿主细胞中的核酸分子可以是非天然的分子或者以对于真菌宿主细胞非天然的形式存在的天然分子。基因缺失可以通过使用缺失质粒来实现。例如，可以将待缺失或破坏的所需基因插入质粒中。然后在适当的限制性酶位点(在所需的基因编码区的内部)切割该缺失质粒，并且用可选择标记替换基因编码序列或其部分。来自待缺失或破坏的基因的基因座的侧翼DNA序列(优选在约0.5至2.0kb之间)保留在可选择标记基因的任一侧上。合适的缺失质粒将通常具有存在于其中的独特限制性酶位点，以使得含有该缺失基因的片段(包括侧翼DNA序列)和可选择标记基因能够作为单一线性小片被去除。缺失质粒还可以通过使用PCR扩增所需侧翼区和可选择标记来构建，在扩增的片段的末端具有限制性酶位点以促进片段的连接。作为另外一种选择，可通过指定适当的侧翼DNA和可选择标记序列来从头合成缺失质粒。在一些实施方案中，所述第一和第二可选择标记是不同的标记。在一些实施方案中，所述第一和第二可选择标记独立地选自alsR、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟素抗性标记、吡啶硫胺素抗性标记、氯嘧磺隆抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因和胸苷激酶。在一些实施方案中，所述同源序列中的至少一个在pyr2序列的上游或下游。在一些实施方案中，所述同源序列在pyr2序列的上游和下游。在其他实施方案中，所述同源序列包含可有效表达一种或多种目的基因或一种或多种变体目的基因的序列和对第一可选择标记赋予第一可选择功能的序列。在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是选自木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、金孢子菌属(Chrysosporium)、镰刀菌属(Fusarium)和裸孢壳属(Emericella)的属中的种。在一些实施方案中，木霉是里氏木霉(T.reesei)，而在其他实施方案中，曲霉是黑曲霉(A.niger)。、本专利技术提供丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述目的基因或变体目的基因选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶(cutinase)、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶及其混合物。目的基因或变体基因的非限制性例子编码：涉及淀粉代谢的蛋白质或酶、涉及糖原代谢的蛋白质或酶、乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶(pectinolyticenzyme)、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC1.1.3.5)、其变体及其组合。在一些实施方案中，目的基因或变体目的基因编码选自下述的多肽：肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子和微生物抗原(例如HBV表面抗原、HPVE7等)及其变体(例如片段)。此外，本专利技术提供在丝状真菌宿主细胞中表达目的基因或变体目的基因的方法，所述方法包括：将对第一可选择标记赋予第一可选择功能的核酸分子引入丝状真菌宿主细胞中，所述核酸分子可以是非天然或天然(但以非天然形式存在)分子；使宿主细胞生长；以及选择具有第一可选择功能但缺乏第二可选择功能的宿主细胞。在一些实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.03 US 61/351,2861.一种丝状真菌宿主细胞表达系统，包含：a.真菌宿主细胞，所述真菌宿主细胞在其染色体DNA中含有非同源重组(NHR)途径的一个或多个组分中的破坏、缺乏第一可选择功能的第一可选择标记、和可有效赋予第二可选择功能的第二可选择标记；和b.核酸分子，所述核酸分子含有(1)当引入所述真菌宿主细胞中时给所述在宿主细胞染色体上的第一可选择标记赋予所述第一可选择功能的序列；(2)可有效表达一种或多种目的基因的序列；(3)和与侧接所述可选择标记的序列具有实质同源性的序列；其中所述同源序列引起同源重组事件，所述同源重组事件导致有功能的第一可选择标记、导致所述第二可选择标记的去除和导致所述目的基因的表达。2.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述NHR途径的一个或多个组分选自ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4和xrs。3.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述第一可选择标记和所述第二可选择标记是选自alsR、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟素抗性标记、吡啶硫胺素抗性标记、氯嘧磺隆抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因和胸苷激酶的不同标记。4.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述真菌宿主细胞来自选自木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、金孢子菌属(Chrysosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、链孢霉属(Neu...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·S·鲍尔，T·卡佩尔，B·R·凯莱门，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：
国别省市：