一种改善丝状真菌蛋白分泌能力的方法技术

本发明专利技术一种改善丝状真菌分泌纤维素酶、半纤维素酶或其它蛋白的方法，属于基因工程领域。所述方法包括对丝状真菌宿主进行遗传操作以缺失或过表达特定基因。本发明专利技术还涉及所述经过遗传操作修饰的宿主。本发明专利技术还是涉及在丝状真菌宿主中改善蛋白质生产，或用于生产改善的蛋白质组合物的方法，所述蛋白为纤维素酶、半纤维素酶、其它参与木质纤维素材料降解的蛋白质和其它蛋白质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，一种生产纤维素酶，提升木质纤维素降解能力和/或提高蛋白分泌能力的方法，所涉及丝状真菌蛋白分泌相关蛋白基因包括：NCU01928, NCU01856、NCU03998, NCU06569, NCU03459，NCU05836和 NCU07516。
技术介绍
随着化石能源的日益耗竭和环境形势的日益严峻，清洁可再生的新型能源越来越受到人们的重视，比如核能，生物能源等。其中生物能源的主要原料为秸秆等木质纤维素类物质，具有来源广泛，成本低廉，环境友好，不额外造成碳排放等优势，因此受到国际社会广泛的关注。然而，生物质原料需先转化为单糖等易利用物质，才能进一步转化为生物乙醇等生物燃料，整个过程中生物质原料的转化尤其是木质纤维素的转化一直是制约生物能源产业的重要瓶颈，构成了生物燃料生产的主要成本，而利用丝状真菌生产纤维素酶降解木质纤维素被认为是经济，环保的生物质原料转化策略，因此研发高产纤维素酶丝状真菌菌株一直受到各国政府，企业，科研机构的广泛关注。丝状真菌纤维素酶合成分泌涉及转录调控，翻译，折叠修饰，转运，分泌出细胞膜等多个系统，几乎涉及已知的细胞内所有代谢和调控途径，是一个非常复杂的过程。例如在转录调控阶段， 敲除CRE1可以解除了碳阻遏效应，极大提高了纤维素酶的表达水平；在转录后的调控阶段，大量的纤维素酶产生会引发内质网应激反应从而激活非折叠蛋白效应和内质网偶联的蛋白质降解途径，提高细胞分泌能力和内质网承载能力。丝状真菌高产纤维素酶不仅要在表达水平上提高纤维素酶相关基因的RNA丰度，还需要我们进一步了解纤维素酶在分泌过程中的效应，减轻甚至消除分泌途径的瓶颈，进一步提高丝状真菌分泌能力。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种提高真菌产纤维素酶生产能力和蛋白分泌能力的菌种改造方法，是通过改造丝状真菌蛋白分泌相关蛋白基因可改善丝状真菌纤维素酶产量和蛋白分泌能力。第一方面，本专利技术提供一种提高真菌产纤维素酶生产能力和蛋白分泌能力的菌种改造方法，敲除六个蛋白之一可提高纤维素酶产量和木质纤维素降解能力和蛋白分泌能力。另一方面，本专利技术提供用于生产纤维素酶的多基因突变菌株，得到的突变菌株与出发菌株相比，获得更强的纤维素酶分泌能力和木质纤维素降解能力；为以下菌株之一：a. 命名为ΔucpΔcre1的基因突变菌株，是敲除NCU01928和碳分解代谢物阻遏效应转录因子CRE1（NCU08807）的微生物菌株；b. 命名为ΔucpΔcre1::Pccg1-hac1s的基因突变菌株，是敲除NCU01928和碳分解代谢物阻遏效应转录因子CRE1（NCU08807）以及过表达非折叠蛋白效应剪切形式HAC1S（NCU01856）的微生物菌株；所述微生物为脉孢菌属、曲霉属、木霉属、青霉属、镰刀霉属、毁丝霉属或侧孢霉属；优选为粗糙脉孢菌和嗜热毁丝霉。所述基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列如下：1）来源于粗糙脉孢菌的NCU01928氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；2）来源于粗糙脉孢菌的NCU01928核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；3）非折叠蛋白效应剪切形式HAC1S（NCU01856）氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；4）非折叠蛋白效应剪切形式HAC1S（NCU01856）核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；5）来源于粗糙脉孢菌的NCU03998氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；6）来源于粗糙脉孢菌的NCU03998核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；7）来源于粗糙脉孢菌的NCU06569氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；8）来源于粗糙脉孢菌的NCU06569核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；9）来源于粗糙脉孢菌的NCU03459氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示；10）来源于粗糙脉孢菌的NCU03459核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.10所示；11）来源于粗糙脉孢菌的NCU05836氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.11所示；12）来源于粗糙脉孢菌的NCU05836核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示；13）来源于粗糙脉孢菌的NCU07516氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.13所示；14）来源于粗糙脉孢菌的NCU07516核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.14所示；所述一种生产纤维素酶或者提升木质纤维素降解能力或蛋白分泌能力的方法包括以下方法之一：1）敲除上述微生物菌株中序列SEQ ID NO.1、5、7、9、11、13所述六个蛋白之一的编码基因；2）敲除上述微生物菌株中NCU01928(UCP)蛋白的编码基因和CRE1蛋白的编码基因；3）敲除上述微生物菌株中NCU01928(UCP)蛋白的编码基因和CRE1蛋白的编码基因并过表达HAC1S的编码mRNA的反转录cDNA。本专利技术另一贡献是通过多基因改造获得的突变体菌株ΔucpΔcre1和ΔucpΔcre1::Pccg1-hac1s，这两株突变菌株能够纤维素为诱导物表达生产纤维素酶,提升木质纤维素降解能力和纤维素酶生产能力，在添加有机氮源酵母提取物的条件下，摇瓶发酵蛋白产量均超过1g/L。本专利技术通过对纤维素酶合成分泌中不同阶段进行改造有效的提高了菌株纤维素酶生产能力和木质纤维素降解能力，包括提高mRNA转录水平，提高内质网承载能力和细胞分泌能力，以及缓解纤维素酶蛋白在胞内被降解。这种不同针对蛋白合成分泌不同阶段的改造方法对丝状真菌高产纤维素酶菌株的改造以及异源蛋白表达系统的构建具有重要的指导意义。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1A：ncu01928(ucp)基因敲除的粗糙脉孢菌在2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的蛋白分泌和纤维素酶生产图1B：ncu01928 (ucp)基因敲除的粗糙脉孢菌在2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的SDS-PAGE图图2A：ncu03998和ncu06569基因敲除的粗糙脉孢菌在2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的蛋白分泌图2B：ncu03459基因敲除的粗糙脉孢菌在2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的蛋白分泌图2C：ncu05836基因敲除的粗糙脉孢菌在2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的蛋白分泌图2D：ncu07516基因敲除的粗糙脉孢菌在2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的蛋白分泌图3A：多基因突变体在2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的蛋白分泌和纤维素酶生产图3B：多基因突变体在2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的SDS-PAGE图图4A：多基因突变体在添加酵母提取物的2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的蛋白分泌和纤维素酶生产图4B：多基因突变体在添加酵母提取物的2%微晶纤维素生长条件下发酵上清的SDS-PAGE图。具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecμlar Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell， David W.，Molecμlar Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，C本文档来自技高网...

【技术保护点】
遗传操作丝状真菌宿主用于改善蛋白质分泌的方法，其包含通过遗传操作使丝状真菌宿主中基因表达水平或活性提高，或是使之表达水平降低或缺失或者使之活性降低或缺失；所述基因选自NCU01928（SEQ ID NO: 1）、NCU01856(SEQ ID NO: 3)、NCU03998（SEQ ID NO: 5）、NCU06569（SEQ ID NO: 7）、NCU03459（SEQ ID NO: 9）、NCU05836（SEQ ID NO: 11）、NCU07516（SEQ ID NO: 13）；或者至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀霉属、青霉属、侧孢霉属、毁丝霉属中最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其它核苷酸序列；所述宿主与出发菌株相比能够提高或减少纤维素酶、半纤维素酶、其它参与降解木质纤维素的蛋白质和/或其它蛋白质的生产。

【技术特征摘要】
1.遗传操作丝状真菌宿主用于改善蛋白质分泌的方法，其包含通过遗传操作使丝状真菌宿主中基因表达水平或活性提高，或是使之表达水平降低或缺失或者使之活性降低或缺失；所述基因选自NCU01928（SEQ ID NO: 1）、NCU01856(SEQ ID NO: 3)、NCU03998（SEQ ID NO: 5）、NCU06569（SEQ ID NO: 7）、NCU03459（SEQ ID NO: 9）、NCU05836（SEQ ID NO: 11）、NCU07516（SEQ ID NO: 13）；或者至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀霉属、青霉属、侧孢霉属、毁丝霉属中最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其它核苷酸序列；所述宿主与出发菌株相比能够提高或减少纤维素酶、半纤维素酶、其它参与降解木质纤维素的蛋白质和/或其它蛋白质的生产。2.根据权利要求1的方法，所述方法包含，丝状真菌宿主经遗传操作后过表达一个或多个基因，所述基因选自：NCU01928（SEQ ID NO: 1）、NCU01856(SEQ ID NO: 3)、NCU03998（SEQ ID NO: 5）、NCU06569（SEQ ID NO: 7）、NCU03459（SEQ ID NO: 9）、NCU05836（SEQ ID NO: 11）、NCU07516（SEQ ID NO: 13）；或者至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀霉属、青霉属、侧孢霉属、毁丝霉属中最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其它核苷酸序列；所述宿主与出发菌株相比能够提高或减少纤维素酶、半纤维素酶、其它参与降解木质纤维素的蛋白质和/或其它蛋白质的生产。3.根据权利要求1或2的方法，所述方法还包含，丝状真菌宿主经遗传操作后一个或多个基因的部分碱基突变、缺失或敲除或减弱表达，所诉基因选自：NCU01928（SEQ ID NO: 1）、NCU01856(SEQ ID NO: 3)、NCU03998（SEQ ID NO: 5）、NCU06569（SEQ ID NO: 7）、NCU03459（SEQ ID NO: 9）、NCU05836（SEQ ID NO: 11）、NCU07516（SEQ ID NO: 13）；或者至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀霉属、青霉属、侧孢霉属、毁丝霉属中最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其它核苷酸序列；所述宿主与出发菌株相比能够提高或减少纤维素酶、半纤维素酶、其它参与降解木质纤维素的蛋白质和/或其它蛋白质的生产。4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述宿主选自木霉属、曲霉属、镰刀霉属、脉孢霉属、青霉属、侧孢霉属、毁丝霉属。5.丝状真菌宿主，通过遗传操作使丝状真菌宿主中基因表达水平或活性提高，或是使之表达水平降低或缺失或者使之活性降低或缺失；所述基因选自NCU01928（SEQ ID NO: 1）、NCU01856(SEQ ID NO: 3)、NCU03998（SEQ ID NO: 5）、NCU06569（SEQ ID NO: 7）、NCU03459（SEQ ID NO: 9）、NCU05836（SEQ ID NO: 11）、NCU07516（...

【专利技术属性】
技术研发人员：田朝光，马国力，樊飞宇，林良才，裴雪，孙文良，刘倩，高染染，李慧燕，陈永，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12