本发明专利技术公开了一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌及其构建与应用，属于生物技术领域。本发明专利技术的重组菌是通过失活α‑葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因后得到的。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术通过对一株高产糖化酶的黑曲霉pyrG缺陷型Aspergillus niger SH‑2:ΔpyrG进行基因工程改造，失活基因agdB、agdA和agdE后，得到低转苷酶活性的新菌株，利用该菌株发酵生产的糖化酶与原始菌株相比，糖化酶酶活增加33％，α‑葡萄糖转苷酶酶活降低43％以上，简化了从发酵液中去除转苷酶的分离纯化工艺，降低了生产成本，具有一定的创新性，有较强的开发意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌及其构建与应用。
技术介绍
糖化酶，系统名为1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶(EC 3.2.1.3)，又名葡糖淀粉酶，是一种外切型糖苷酶，能够催化淀粉或有关寡糖和多糖分子的非还原端释放出D-葡萄糖。在商业上，糖化酶常用于转化已由α-淀粉酶部分水解为葡萄糖的玉米淀粉，是淀粉加工业的主要酶制剂。近年来，国内生产的糖化酶的活力和产量均取得了很大的进展，但是存在糖化酶中α-葡萄糖转苷酶活性较高的问题。黑曲霉Aspergillus niger SH-2是工业上常用的高产糖化酶菌株，其显著特点是不产孢子，进行无性繁殖，可以进行高密度液体发酵，高效地生产工业用糖化酶。而且，工业生产菌株无孢黑曲霉Aspergillus niger SH-2已于2014年完成基因组测序、组装和注释，对其基因组和遗传学信息有了进一步了解。通过敲除pyrG基因得到的黑曲霉Aspergillus niger SH-2的pyrG缺陷型Aspergillus niger SH-2:ΔpyrG，可将pyrG基因作为筛选标记，简化了黑曲霉基因工程改造的筛选步骤，提高了黑曲霉基因工程改造菌的应用价值。工业上常常利用黑曲霉Aspergillus niger SH-2深层液体发酵生产糖化酶，但是利用该菌株发酵生产的糖化酶中含有较高活性的α-葡萄糖转苷酶，该酶不仅具有水解活性，还具有转糖苷能力，生成的异麦芽糖或潘糖等非发酵性糖严重影响了糖化酶的质量。转苷酶产生的这些产物不能被糖化酶分解，同时，异麦芽糖的存在还阻碍了葡萄糖的结晶，严重影响了葡萄糖生产中最终产物的纯度和产率。而且工业上使用的去除糖化酶中的转苷酶的方法的效果均不理想，不仅增加了糖化酶发酵生产工艺的工序，还增加了糖化酶生产的成本，降低了工业生产效率。专利CN104962594A公开了一种黑曲霉，其特征是失活对糖化有害的α-葡萄糖苷酶agdB基因，将其生产的目的蛋白用于葡萄糖转化时，能显著提高DX值。但是该专利中没有记载将α-葡萄糖苷酶基因agdB、agdA和agdE缺失后能有效提高糖化酶的活性。
技术实现思路
为了克服现有技术中高产糖化酶的黑曲霉工业菌种发酵生产的糖化酶中α-葡萄糖转苷酶活性较高的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌。本专利技术通过基因敲除技术改造该黑曲霉菌种，从源头上减少或不产α-葡萄糖转苷酶，避免了糖化酶纯化中去除α-葡萄糖转苷酶的工序，节省生产成本，提高生产效率。本专利技术的另一目的在于提供所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌的构建
方法。本专利技术的再一目的在于提供所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，是对高产糖化酶的黑曲霉进行基因工程改造获得的重组菌；所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)、α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)、α-葡萄糖转苷酶表达基因G(agdG)、α-葡萄糖转苷酶表达基因F(agdF)、α-葡萄糖转苷酶表达基因C(agdC)和α-葡萄糖转苷酶表达基因D(agdD)中的至少一种；优选为至少2种；更优选为至少3种；最优选为3种。所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，是对高产糖化酶的黑曲霉进行基因工程改造获得的重组菌；所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)，或失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)和α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)，或失活α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)、α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)、α-葡萄糖转苷酶表达基因G(agdG)、α-葡萄糖转苷酶表达基因F(agdF)、α-葡萄糖转苷酶表达基因C(agdC)和α-葡萄糖转苷酶表达基因D(agdD)。优选地，所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)和α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)，或失活α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)、α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)、α-葡萄糖转苷酶表达基因G(agdG)、α-葡萄糖转苷酶表达基因F(agdF)、α-葡萄糖转苷酶表达基因C(agdC)和α-葡萄糖转苷酶表达基因D(agdD)。更优选地，所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)和α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)。所述基因agdB的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:1所示；所述基因agdA的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:2所示；所述基因agdE的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:3所示；所述基因agdG的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:4所示；所述基因agdF的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:5所示；所述基因agdC的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:6所示；所述基因agdD的核苷酸序列如序列表中的序列SEQ ID NO:7所示。所述的高产糖化酶的黑曲霉为无孢黑曲霉(Aspergillus niger)SH-2经过敲除pyrG基因获得的pyrG缺陷型菌株，命名为黑曲霉SH-2:ΔpyrG，该菌株在文献“黑曲霉来源脯氨酞蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2中表达的研究.华南理工大学[D].2014”中被公开。具体步骤参照文献“黑曲霉来源脯氨酞蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2中表达的研究.华南理工大学[D].2014”。所述的无孢黑曲霉(Aspergillus niger)SH-2在文献“黑曲霉来源脯氨酞蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2中表达的研究.华南理工大学[D].2014”中被公开。上述重组菌中，所述失活高产糖化酶的黑曲霉中的与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因为删除各种所述基因的全部或者部分重要编码框，即敲除各种所述基因的全部或者
部分重要编码框；以及其他一些方式，使该基因不能表达产物或者表达产物没有功能。本专利技术所提供的黑曲霉改造菌株敲除了与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因，通过测定该改造菌株相较于野生型的转苷酶和糖化酶的相对酶活实现对该敲除菌株的评价。一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌的构建方法，包括如下步骤：失活高产糖化酶的黑曲霉中的所述与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因，得到的重组菌。所述失活高产糖化酶的黑曲霉中的所述与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因具体通过同源重组实现。所述与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因为α-葡萄糖转苷酶表达基因B(agdB)、α-葡萄糖转苷酶表达基因A(agdA)、α-葡萄糖转苷酶表达基因E(agdE)、α-葡萄糖转苷酶表达基因G(agdG)、α本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，其特征在于：是对高产糖化酶的黑曲霉进行基因工程改造获得的重组菌；所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中agdB、agdA、agdE、agdG、agdF、agdC和agdD中的至少一种；所述基因agdB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述基因agdA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述基因agdE的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述基因agdG的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述基因agdF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述基因agdC的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述基因agdD的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述的高产糖化酶的黑曲霉为无孢黑曲霉(Aspergillus niger)SH‑2经过敲除pyrG基因获得的pyrG缺陷型菌株，命名为黑曲霉SH‑2:ΔpyrG。
【技术特征摘要】
1.一种低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，其特征在于：是对高产糖化酶的黑曲霉进行基因工程改造获得的重组菌；所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中agdB、agdA、agdE、agdG、agdF、agdC和agdD中的至少一种；所述基因agdB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述基因agdA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述基因agdE的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述基因agdG的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述基因agdF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述基因agdC的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述基因agdD的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述的高产糖化酶的黑曲霉为无孢黑曲霉(Aspergillus niger)SH-2经过敲除pyrG基因获得的pyrG缺陷型菌株，命名为黑曲霉SH-2:ΔpyrG。2.根据权利要求1所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，其特征在于：是对高产糖化酶的黑曲霉进行基因工程改造获得的重组菌；所述基因工程改造为失活所述高产糖化酶的黑曲霉中agdB，或失活所述高产糖化酶的黑曲霉中agdB、agdA和agdE，或失活agdB、agdA、agdE、agdG、agdF、agdC和agdD。3.根据权利要求1所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌，其特征在于：所述失活高产糖化酶的黑曲霉中的与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因为使该基因不能表达产物或者表达产物没有功能。4.权利要求1～3任一项所述的低转苷酶背景的糖化酶高产菌基因敲除重组菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：失活高产糖化酶的黑曲霉中的所述与α-葡萄糖转苷酶表达相关的一个或多个基因，得到的重组菌。...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘力，杨海燕，王斌，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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