本发明专利技术公开了一种生淀粉糖化酶的制备方法及其在生淀粉水解和生料同步糖化发酵生产酒精中的应用。本发明专利技术提供一种经过密码子优化后的生淀粉糖化酶基因，其核苷酸序列为如下A1)‑A5)中任一所示：A1)序列表中序列3；A2)序列表中序列3的第1‑1878位核苷酸；A3)序列表中序列3的第19‑1878位核苷酸所示的DNA分子；A4)序列表中序列3的第19‑1857位核苷酸所示的DNA分子；A5)与A1)或A2)或A3)或A4)所限定的序列至少具有98％的同一性，且编码序列表序列4所示蛋白质的序列。实验证明，本发明专利技术所提供的生淀粉糖化酶基因能够在异源表达系统中高效表达获得一种生淀粉糖化酶rPoGA15A，该酶与α‑淀粉酶协同作用可以快速高效水解生淀粉和实现生淀粉同步糖化发酵生产酒精。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中一种生淀粉糖化酶的制备方法，尤其涉及生淀粉糖化酶rPoGA15A的制备方法及其生淀粉糖化酶rPoGA15A在生淀粉水解和生料同步糖化发酵生产酒精中的应用。
技术介绍
植物通过光合作用合成的淀粉是自然界植物中的最主要的贮藏性碳水化合物之一，淀粉在植物的种子(如水稻、小麦、玉米、高粱等)及根茎(如木薯、马铃薯等)中含量较高，其产量仅次于纤维素。淀粉是葡萄糖分子的聚合物，包括α-1,4-糖苷键连接的一条直链，以及α-1,6-糖苷键构成位置随机且数量不定的分枝点，在分枝点可连接长度不同的直链。淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉两类，前者的葡萄糖分子以α-1,4糖苷键形式连接，而后者的葡萄糖分子以α-1,4和α-1,6糖苷键连接(Vamadevan V,Bertoft E.Structure-function relationships of starch components.Starch/2015,67:55-68)。在食品加工工业中，淀粉可被用作原料通过水解生产葡萄糖、果糖及果葡糖浆(Glucose-fructose syrup)等(Waterschoot J,Gomand SV,Fierens E,Delcour JA.Production,structure,physicochemical and functional properties of maize,cassava,wheat,potato and rice starches.Starch/2015,67:14-29)；此外，在发酵工业中，淀粉还可以被作为重要的原料用于发酵生产酒精(Favaro L,Viktor MJ,Rose SH,Viljoen-Bloom M,van Zyl WH,Basaglia M,Cagnin L,Casella S.Consolidated bioprocessing of starchy substrates into ethanol by industrial Saccharomyces cerevisiae strains secreting fungal amylases.Biotechnology and Bioengineering,2015,112:1751-1760)。在目前的淀粉水解工艺中，主要采用两步法对淀粉水解产生葡萄糖，包括淀粉的高温液化和高温糖化两个步骤，这两步中分别使用的关键酶主要有α-淀粉酶和糖化酶。在第一步高温液化过程中，首先将淀粉在高温下加热糊化，之后加入来源于细菌的耐热型的α-淀粉酶，在pH 6.0–6.5及95–105℃高温条件下快速液化成糊精及小分子寡糖；在第二步高温糖化过程中，将水解糊化液冷却至60–65℃左右，调节pH至4.0–4.5后，向其中加入来源于黑曲霉的糖化酶，再将糊精和小分子寡糖进一步水解成葡萄糖(Sánchez OJ,Cardona CA.Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks.Bioresource Technology,2008,99:5270-5295)。淀粉在糊化、液化和水解糖化的过程中需要高温蒸煮及连续加热，消耗了大量能量，也增加了设备的投入，大大提高了生产成本。同时，糖化酶和α-淀粉酶最适作用pH也不相同，需要反复调节pH，浪费了试剂的同时也给环境造成了污染(JF,Bressler DC,van Rensburg E.Engineering Saccharomyces cerevisiae for direct conversion of raw,uncooked or granular starch to ethanol.Critical Reviews in Biotechnology,2015,
35:369-391)。不管是淀粉水解生产果葡糖浆或者以淀粉为原料进行发酵生产酒精，首先都需要将淀粉水解成葡萄糖分子，而当前淀粉水解所使用的工业淀粉酶都不能将生淀粉有效地水解，开发在较低温度下能直接将未经蒸煮的生淀粉水解糖化的生淀粉酶意义重大(Wang P,Singh V,Xue H,Johnston DB,Rausch KD,Tumbleson ME.Comparison of raw starch hydrolyzing enzyme with conventional liquefaction and saccharification enzymes in dry-grind corn processing.Cereal Chemistry,2007,84:10-14；Cinell i BA,Casti lho LR,Freire DMG,Castro AM.A brief review on the emerging technology of ethanol production by cold hydrolysis of raw starch.Fuel,2015,150:721-729)。将生淀粉酶应用于以淀粉原料的酒精生产中可以减少占所生产出的酒精的燃烧值的10-20％的能量消耗(Robertson GH,Wong DWS,Lee CC,Wagschal K,Smith,MR,Orts WJ.Native or raw starch digestion:a key step in energy efficient biorefining of grain.Journal of Agriculture and Food Chemistry,2006,54:353-365；JF,Bressler DC,van Rensburg E.Engineering Saccharomyces cerevisiae for direct conversion of raw,uncooked or granular starch to ethanol.Critical Reviews in Biotechnology,2015,35:369-391)。生淀粉酶是指具有能将未经蒸煮的生淀粉直接水解的酶类，主要包括α-生淀粉酶、β-生淀粉酶和生淀粉糖化酶(Raw starch-digesting glucoamylase,RSDG)等。生淀粉酶广泛存在于动物、植物、微生物中，微生物中主要有黑曲霉、米曲霉、青霉、芽孢杆菌和海洋酵母等产生生淀粉酶(Sun H,Zhao P,Ge X,Xia Y,Hao Z,Liu J,Peng M.Recent advances in microbial raw starch degrading enzymes.Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,160:988-1003)。其中，生淀粉糖化酶能直接将生淀粉水解成葡萄糖，可以改变传统淀粉水解加工工艺，直接将糊化、液化及糖化多步合并为一步进行，具有较好的开发和应用前景(Sun HY,Ge XY,Zhang WG.Production of a novel r本文档来自技高网...
【技术保护点】
DNA分子，为如下A1)‑A5)中任一DNA分子：A1)序列表中序列3所示的DNA分子；A2)序列表中序列3的第1‑1878位核苷酸所示的DNA分子；A3)序列表中序列3的第19‑1878位核苷酸所示的DNA分子；A4)序列表中序列3的第19‑1857位核苷酸所示的DNA分子；A5)与A1)或A2)或A3)或A3)所限定的DNA分子至少具有98％的同一性，且序列表序列4所示蛋白质的DNA分子。
【技术特征摘要】
1.DNA分子，为如下A1)-A5)中任一DNA分子：A1)序列表中序列3所示的DNA分子；A2)序列表中序列3的第1-1878位核苷酸所示的DNA分子；A3)序列表中序列3的第19-1878位核苷酸所示的DNA分子；A4)序列表中序列3的第19-1857位核苷酸所示的DNA分子；A5)与A1)或A2)或A3)或A3)所限定的DNA分子至少具有98％的同一性，且序列表序列4所示蛋白质的DNA分子。2.蛋白质为如下为a)或b)或c)或d)或e)或f)：a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列4第7-625所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；d)由序列表中序列2第23-635位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；e)在a)或b)或c)或d)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；f)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质是通过将权利要求1所述的DNA分子在生物细胞中进行表达得到的。4.与权利要求2所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B5)中至少一种；B1)编码权利要求2所述的蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯家勋，徐强胜，闫语丝，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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