一种绵羊MSTN基因定向敲除及其影响成肌分化的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种应用CRISPR/Cas9技术对绵羊MSTN基因进行定向敲除，并验证其对骨骼肌卫星细胞分化影响效果的方法，具体内容如下：(1)目的基因克隆；(2)gRNA设计及合成；(3)CRISPR/Cas9基因敲除载体构建；(4)CRISPR/Cas9基因敲除载体外源活性检测；(5)CRISPR/Cas9基因敲除载体内源活性检测；(6)CRISPR/Cas9基因敲除载体敲除效果检测。本发明专利技术的优越性在于：1、实验周期较短速；2、方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行；3、运用该方法构建的活性载体，毒副作用小，可用于转基因动物的制备与生产；4、该方法非特异剪切较少，显著提高了基因靶向敲除效率高。5、该方法适用性高。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种绵羊MSTN基因定向敲除及其影响成肌分化的检测方法，属于分子生物学、基因工程学和转基因技术等领域。技术背景：目前研究负反馈调节基因的功能主要是运用人工核酸内切酶(Engineeredendonuclease,EEN)技术对基因进行靶向敲除并进行功能性验证，目前应用比较广泛的ENN主要有ZFN(Zinc-fingernuclease,ZFN)和TALEN(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)，然而ZFN技术因具有较低特异性的同源二聚体形式而剪切特异性较差、细胞毒性大。TALEN作为第二代EEN技术在特异性剪切方面有了一定的提高，但仍具有较大细胞毒性。这两种技术的实验过程繁琐，设计也较复杂，新型CRISPR/Cas9系统作为第三代ENN技术是模仿细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统而诞生的，作为第三代ENN技术的Cas9系统则是这两年兴起的一种快速靶向基因敲除技术，其具有实验过程简单、耗时短和工作量小等优势，且更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变，具有良好的发展前景，因此，Cas9系统正逐渐地取代ZFN和TALEN技术。目前研究人员已经利用Cas9系统在小鼠、斑马鱼和果蝇等动物中成功的构建了基因敲除模型，并在HEK293和iPS等细胞中实现了基因的敲除并产生了稳定的细胞系，实现了基因的定点修饰及其功能研究。
技术实现思路
：针对传统ENN技术实验繁琐、效率低、毒性大的缺点，提供一种绵羊MSTN基因定向敲除及其影响成肌分化的检测方法。本专利技术包括以下步骤：(1)目的基因克隆查询NCBI数据库，获取绵羊目的基因的CDS序列(序列号：NM_001009428)，设计特异性引物，以湖羊肌肉组织总RNA反转录形成的cDNA为模板克隆并获得目的基因全部CDS序列，纯化回收后送公司测序，通过比对得到完整的目的基因外显子序列以及突变位点信息；(2)gRNA设计及合成避开突变位点，在外显子区寻找PAM序列，并在PAM序列前20bp左右设计靶序列，所有的靶序列在全基因组比对，无同源性的靶位点作为gRNA并合成；(3)CRISPR/Cas9基因敲除载体构建将gRNA连入基础载体VK001-02，以人源U6启动子启动gRNA的表达，T7启动子启动Cas9酶的表达，插入GFP绿色荧光基因作为报告基因，以及puro基因作为抗性药筛基因。(4)CRISPR/Cas9基因敲除载体外源活性检测将gRNA序列(包括PAM序列)通过搭桥PCR的方式构建到PCR产物框架中合成酶切DNA，体外转录gRNA加入反应体系，并以已知SSA活性的标准品为对照，Cas9酶体外切割反应检测luciferase信号，通过比对酶切条带灰度获得luciferase活性，luciferase活性越高则gRNA体外Cas9酶切活性越高；(5)CRISPR/Cas9基因敲除载体内源活性检测选择剪切活性较高CRISPR/Cas9敲除载体转染状态良好的绵羊耳成纤维细胞，24h后用嘌呤霉素筛选出阳性细胞，提取基因组DNA，克隆出靶位点前后1000bp左右片段(靶点不要位于正中间，便于分辨酶切条带)，T7E1酶进行活性检测，若存在敲除活性，将产生非配对DNA片段，即能被非配对内切酶--T7核酸内切酶I剪切；若没有发生突变，将产生配对DNA片段，而无法被非配对内切酶--T7核酸内切酶I剪切；(6)CRISPR/Cas9基因敲除载体敲除效果检测选择兼有外源活性和内源活性的载体，脂质体介导法转染绵羊骨骼肌卫星细胞，48h后用嘌呤霉素筛选出阳性细胞，加入增殖培养基正常培养至细胞密度达到40-50％，降低血清浓度至1％饥饿诱导卫星细胞成肌分化，同时以正常培养的细胞同期诱导作为对照。诱导72h，统计肌管形成数目。本专利技术公开了一种应用CRISPR/Cas9技术对绵羊MSTN基因进行定向敲除，并验证其对骨骼肌卫星细胞分化影响效果的方法，具体内容如下：(1)载体构建：在NCBI上查询绵羊MSTN基因的CDS序列，克隆并测序以获得SNP位点，避开突变位点设计CRISPR/Cas9敲除靶位点作为gRNA，以VK001-02为基础载体构建CRISPR/Cas9双启动子敲除载体，并插入GFP蛋白作为报告基因以及puro基因作为药筛基因；(2)载体活性检测：将gRNA序列(包括PAM序列)通过搭桥PCR的方式构建到PCR产物框架中合成酶切DNA，以已知SSA活性的标准品为对照，Cas9酶切反应后比对条带灰度获取luciferase信号，选取体外Cas9酶切活性最高的gRNA进行内源活性验证；将筛选出来的载体质粒以脂质体介导法转染状态良好的绵羊耳成纤维细胞，24h后嘌呤霉素筛选阳性细胞，提取基因组DNA，克隆出靶位点前后1000bp左右片段，T7E1酶进行剪切活性检测，若存在敲除活性，将产生非配对DNA片段；(3)成肌分化验证：选择兼有外源活性和内源活性的载体，脂质体介导法转染绵羊骨骼肌卫星细胞，48h后用嘌呤霉素筛选出阳性细胞，加入增殖培养基正常培养至细胞密度达到40-50％，1％血清浓度饥饿诱导肌肉卫星细胞成肌分化，同时以正常培养的细胞同期诱导作为对照。诱导72h，间接免疫荧光染色统计肌管形成数目。传统的ZFN技术因具有较低特异性的同源二聚体形式会切割基因组中的假回文序列，而单一ZFN单元结合于DNA也会造成DNA的剪切，这些非特异性剪切都会影响基因敲除效率，甚至可能引起细胞毒性。TALEN作为第二代EEN技术在特异性剪切方面有了很大的提高，但仍具有一定细胞毒性，且模块组装过程繁琐，需要较多人力物力。新型CRISPR/Cas9系统模仿细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统，更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变，具有良好的发展前景。本专利技术采用新型CRISPR/Cas9技术对绵羊MSTN基因实施定点敲除，评估敲除效率，并验证MSTN基因缺失表达对于骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响。采用本方法，本方法简单易行，实验者可以在两个月内完成目的基因Cas9敲除载体的构建及活性验证，且靶向敲除效率明显高于传统ENN技术，MSTN基因的体外Cas9酶切活性高达90％以上。此外本方法对细胞的毒性作用很小，为后期功能性验证和转基因动物个体制备提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绵羊MSTN基因定向敲除及其影响成肌分化的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)目的基因克隆查询NCBI数据库，获取绵羊目的基因的CDS序列，绵羊目的基因的CDS序列的序列号为NM_001009428，设计特异性引物，以湖羊肌肉组织总RNA反转录形成的cDNA为模板克隆并获得目的基因全部CDS序列，纯化回收后送公司测序，通过比对得到完整的目的基因外显子序列以及突变位点信息；(2)gRNA设计及合成避开突变位点，在外显子区寻找PAM序列，并在PAM序列前20bp左右设计靶序列，所有的靶序列在全基因组比对，无同源性的靶位点作为gRNA并合成；(3)CRISPR/Cas9基因敲除载体构建将gRNA连入基础载体VK001‑02，以人源U6启动子启动gRNA的表达，T7启动子启动Cas9酶的表达，插入GFP绿色荧光基因作为报告基因，以及puro基因作为抗性药筛基因；(4)CRISPR/Cas9基因敲除载体外源活性检测将gRNA序列，包括PAM序列，通过搭桥PCR的方式构建到PCR产物框架中合成酶切DNA，体外转录gRNA加入反应体系，并以已知SSA活性的标准品为对照，Cas9酶切反应检测luciferase信号，通过比对酶切条带灰度获得luciferase活性，luciferase活性越高则gRNA体外Cas9酶切活性越高；(5)CRISPR/Cas9基因敲除载体内源活性检测选择剪切活性较高CRISPR/Cas9敲除载体转染状态良好的绵羊耳成纤维细胞，24h后用嘌呤霉素筛选出阳性细胞，提取基因组DNA，克隆出靶位点前后1000bp左右片段，靶位点不要放在正中，避免酶切条带重合；T7E1酶进行活性检测，若存在敲除活性，将产生非配对DNA片段，即能被非配对内切酶‑‑T7核酸内切酶I剪切；若没有发生突变，将产生配对DNA片段，而无法被非配对内切酶‑‑T7核酸内切酶I剪切；(6)CRISPR/Cas9基因敲除载体敲除效果检测选择兼有外源活性和内源活性的载体，脂质体介导法转染绵羊骨骼肌卫星细胞，48h后用嘌呤霉素连续筛选72h，加入增殖培养基正常培养至细胞密度达到40‑50％，1％血清浓度饥饿法诱导卫星细胞成肌分化，同时以正常培养的细胞同期诱导作为对照，诱导72h，间接免疫荧光染色统计肌管形成数目。...

【技术特征摘要】
1.一种绵羊MSTN基因定向敲除及其影响成肌分化的检测方法，其特征在
于，包括如下步骤：
(1)目的基因克隆
查询NCBI数据库，获取绵羊目的基因的CDS序列，绵羊目的基因的CDS
序列的序列号为NM_001009428，设计特异性引物，以湖羊肌肉组织总RNA反
转录形成的cDNA为模板克隆并获得目的基因全部CDS序列，纯化回收后送公
司测序，通过比对得到完整的目的基因外显子序列以及突变位点信息；
(2)gRNA设计及合成
避开突变位点，在外显子区寻找PAM序列，并在PAM序列前20bp左右设
计靶序列，所有的靶序列在全基因组比对，无同源性的靶位点作为gRNA并合
成；
(3)CRISPR/Cas9基因敲除载体构建
将gRNA连入基础载体VK001-02，以人源U6启动子启动gRNA的表达，
T7启动子启动Cas9酶的表达，插入GFP绿色荧光基因作为报告基因，以及puro
基因作为抗性药筛基因；
(4)CRISPR/Cas9基因敲除载体外源活性检测
将gRNA序列，包括PAM序列，通过搭桥PCR的方式构建到PCR产物框
架中合成酶切DNA，体外转录gRNA加入反应体系，并以已知SSA活性的标准
品为对照，Cas9酶切反应检测luciferase信号，通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：李碧春，汤贝贝，张亚妮，王颖洁，左其生，李东，纪艳芹，连超，王飞，路镇宇，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32