本发明专利技术提供了一种高效基因敲除载体的构建方法,本发明专利技术利用了高效负筛选标记基因与USER酶克隆技术，在载体中构建酶切位点，使载体在酶切后可以产生与USER酶酶切后的目的基因上下游片段互补的粘性末端，同时在载体中还构建了高效负筛选标记基因，并将构建的载体成功用于大丽轮枝菌V592目的基因的敲除，实验证明，利用本发明专利技术方法构建的载体大大缩短了大丽轮枝菌目的基因的研究周期，加快了大丽轮枝菌功能基因的研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术总地涉及生物
，具体涉及一种高效基因敲除载体及其构建方法与应用。
技术介绍
随着基因测序技术的提高和测序成本的降低，越来越多的真菌的基因组被测序(http://www.broadinstitute.org//scientific-community/data)，得到了大量的基因数据，但是欠缺有力的实验证据证明相关基因的功能，迫切需要有效的快速检测基因功能的方法的出现。当前研究最热的两种基因编辑技术：TALEN和CRISP-CAS9被用于了真菌基因组功能的研究鲜有报道。由于真菌具有特殊的基因修复的机制：同源重组，这一机制为研究真菌基因组的功能带来了便利，利用同源重组的原理进行真菌基因组的敲除已经成为了真菌功能研究的最主要的方法。通过构建目的基因同源臂来实现对目的基因的敲除是目前实验室常用的思路。传统的构建方法包括几步的转化连接，耗时耗力最终能够构建好目的基因的敲除载体。近些年来，为了加快真菌基因组的研究，不少实验室专利技术了快速构建和敲除真菌基因组的方法。主要包括Davidson的overlapPCR(Davidsonetal.,2002),Catlett的split-markerdeletionmethod(Catlettetal.,2002)，的PCRandrestrictionenzymedigestionandligation(2004)，D.的DelsGate(2007)ZahiPaz的OSCAR，ChuanXu的改进OSCAR(ΔMrKu70).这些所有的方法中，只考虑到了如何优化真菌基因载体的构建，但是对于目的基因的敲除，后面阳性转化子的筛选工作才是最为重要和繁琐的工作。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因是肿瘤基因治疗研究中常用的自杀基因。其作用原理，是因为某些特定的酶蛋白基因如HSV-TK、CD基因等编码的酶蛋白，可以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。ChangHyunKhang(FungalGeneticsandBiology42(2005)483–492)等人在2004年第一次将HSV-tk用于真菌敲除转化子的筛选，很大的提高了真菌目的基因敲除的阳性率。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高效基因敲除载体及其构建方法与应用，本专利技术的一个方面，提供一种高效基因敲除载体的构建方法,包括如下步骤：(1)将带有HSV-tk基因的载体PGKO-Gateway通过XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收酶切后的载体大片段；(2)将载体Psul-EGFP通过XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收酶切后的载体短片段；(3)连接步骤(1)和步骤(2)中获得的所述载体大片段和所述载体短片段，获得载体PGKO-EGFP；(4)将所述载体PGKO-EGFP用SmalⅠ和HindⅢ双酶切，回收含有HindⅢ和SmalⅠ酶切位点的载体片段；(5)以载体pRF-HU2为模板通过引物prf-pgko-s和prf-pgko-a扩增带有Nt.BbvCI和PacⅠ酶切位点的能够表达潮霉素的基因片段；(6)回收步骤(5)的扩增产物直接与步骤(4)中所述含有HindⅢ和SmalⅠ酶切位点的载体片段进行酶切连接；(7)步骤(6)的产物转化受体菌，选取经验证的阳性克隆的质粒即为所述高效基因敲除载体。在上述构建方法中，步骤(5)中所述引物prf-pgko-s和prf-pgko-a序列为：上游引物Prf-pgko-s：5’-AATTAAGGGAGTCACGAAGCTTGCT-3’；下游引物Prf-pgko-a：5’-TCCCCCGGGCGGCCAGTGAATTCGAGCTCGCT-3’。在上述构建方法中，所述HSV-tk基因的序列如SEQIDNO.1所示。在上述构建方法中，所述带有Nt.BbvCI酶切位点和PacⅠ酶切位点的能够表达潮霉素的基因片段的序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的另一个方面，提供以上任一构建方法构建的载体。本专利技术的再一个方面，提供以上所述的载体在目的基因敲除上的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)PacⅠ酶切以上方法构建的载体，获得线性载体；(2)扩增目的基因上游片段及下游片段；(3)通过USER酶连接步骤(1)所述的线性载体和步骤(2)所述的目的基因的上游片段和下游片段，测序验证阳性质粒；(4)步骤(3)中验证正确的阳性质粒转化受体菌感受态细胞，扩增培养，培养产物在含有抗生素的培养基上培养；(5)在步骤(4)中含有抗生素的培养基上选取单菌落进行PCR验证，验证正确的菌株即为敲除了目的基因的菌株。在上述应用中应用，所述步骤(2)中扩增目的基因上游片段及下游片段使用的引物的5’端分别添加如下片段：上游片段正向引物序列添加片段：5’-GGCATTAAU；上游片段反向引物序列添加片段：5’-GGTCTTAAU；下游片段正向引物序列添加片段：5’-GGGTTTAAU；下游片段反向引物序列添加片段：5’-GGACTTAAU。在上述应用中，所述受体菌为农杆菌。本专利技术利用了高效负筛选标记基因与USER酶克隆技术，在载体中构建酶切位点，使载体在酶切后可以产生与USER酶酶切后的目的基因上下游片段互补的粘性末端，同时在载体中还构建了高效负筛选标记基因，并将构建的载体成功用于大丽轮枝菌V592目的基因的敲除，实验证明，利用本专利技术方法构建的载体大大缩短了大丽轮枝菌目的基因的研究周期，加快了大丽轮枝菌功能基因的研究。本专利技术的方法构建的高效基因敲除载体在应用时只需要一步PCR连接转化即可构建好含有负向选择标签的目的基因的敲除载体(通过Nt.BbvCI和PacⅠ酶切消化后的载体具有与USER酶处理后的目的基因上下游片段互补的粘性末端，可以一步直接连接)，构建过程中不用考虑各种酶切位点。由于具有高效负筛选标记HSV-tk基因，在外源施加工作浓度为20ug/ml的5-氟尿嘧啶(CAS:F0503，SIGMA)时，HSV-tk编码的蛋白能以5-氟尿嘧啶为底物掺入到DNA的合成中，破坏DNA正常的编码蛋白的功能从而抑制或者杀死细胞,从而可以抑制或杀死未正确敲除目的基因的菌体细胞，使阳性率高，可达到100％。附图说明图1为载体pRF-HU2的质粒图谱；图2为载体PGKO-Gateway的质粒图谱；图3为载体psul-EGFP的质粒图谱；图4为载体PGKO-HPT的质粒图谱；图5为载体PGKO-Gateway通过XbaⅠ和HindⅢ双酶切后电泳图(左起泳道1为Maker，泳道2为酶切后的DNA片段)；图6为载体Psul-EGFP通过XbaⅠ和HindⅢ双酶切后电泳图(左起泳道1为Maker，泳道2为酶切后的DNA片段)；图7为载体PGKO-EGFP用SmalⅠ和HindⅢ双酶切后电泳图(左起泳道1为Maker，泳道2为酶切后的DNA片段)；图8为通过引物prf-pgko-s和prf-pgko-a扩增的表达潮霉素的基因片段(HPT)的电泳图(左起泳道1为Maker，泳道2为扩增后的DNA片段)；图9为本专利技术的重组质粒载体的SmalⅠ和HindⅢ双酶切后电泳图(左起泳道1为Maker，泳道2为酶切后的DNA片段)；图10为利用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效基因敲除载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤：(1)将带有HSV‑tk基因的载体PGKO‑Gateway通过Xba Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，回收酶切后的载体大片段；(2)将载体Psul‑EGFP通过Xba Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，回收酶切后的载体短片段；(3)连接步骤(1)和步骤(2)中获得的所述载体大片段和所述载体短片段，获得载体PGKO‑EGFP；(4)将所述载体PGKO‑EGFP用Smal Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，回收含有Hind Ⅲ和Smal Ⅰ酶切位点的载体片段；(5)以载体pRF‑HU2为模板通过引物prf‑pgko‑s和prf‑pgko‑a扩增带有Nt.BbvCI和Pac Ⅰ酶切位点的能够表达潮霉素的基因片段；(6)回收步骤(5)的扩增产物直接与步骤(4)中所述含有Hind Ⅲ和Smal Ⅰ酶切位点的载体片段进行酶切连接；(7)步骤(6)的产物转化受体菌，选取经验证的阳性克隆的质粒即为所述高效基因敲除载体。
【技术特征摘要】
1.一种高效基因敲除载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤：(1)将带有HSV-tk基因的载体PGKO-Gateway通过XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收酶切后的载体大片段；(2)将载体Psul-EGFP通过XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收酶切后的载体短片段；(3)连接步骤(1)和步骤(2)中获得的所述载体大片段和所述载体短片段，获得载体PGKO-EGFP；(4)将所述载体PGKO-EGFP用SmalⅠ和HindⅢ双酶切，回收含有HindⅢ和SmalⅠ酶切位点的载体片段；(5)以载体pRF-HU2为模板通过引物prf-pgko-s和prf-pgko-a扩增带有Nt.BbvCI和PacⅠ酶切位点的能够表达潮霉素的基因片段；(6)回收步骤(5)的扩增产物直接与步骤(4)中所述含有HindⅢ和SmalⅠ酶切位点的载体片段进行酶切连接；(7)步骤(6)的产物转化受体菌，选取经验证的阳性克隆的质粒即为所述高效基因敲除载体。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述引物prf-pgko-s和prf-pgko-a序列为：上游引物Prf-pgko-s：5’-AATTAAGGGAGTCACGAAGCTTGCT-3’；下游引物Prf-pgko-a：5’-TCCCCCGGGCGGCCAGTGAATTCGAGCTCGCT-3’。3.如权利要求1所述的构建方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭惠珊，王胜，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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