构建灵长类动物miRNA-122敲除模型的方法、灵长类动物肝癌模型及用途技术

构建灵长类动物肝癌模型的方法，包括以下步骤：a)将特异性靶向miR122的gRNA序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录miR122的模板载体；b)将cas9基因的序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录cas9基因的模板载体；c)以步骤a)中的载体为模板进行PCR扩增，得到体外转录miR122的gRNA的模板；d)用限制性内切酶将步骤b)中的模板载体线性化，得到体外转录cas9基因的模板；e)以步骤c)和d)中的产物为模板进行体外转录，得到特异性靶向miR122的gRNA和cas9基因的mRNA；f)将步骤e)中的gRNA和mRNA注射到所述动物的受精卵细胞中，或者注射到卵母细胞中，再与所述动物的精子进行体外受精得到受精卵细胞；g)将步骤f)中的受精卵细胞移植入所述动物的子宫中，由此产生稳定的敲除miR122的动物子代。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种构建灵长类动物肝癌模型的方法、动物肝癌模型及用该模型筛选药物的方法。特别涉及用表达于肝脏的miRNAmiR-122构建猴肝癌模型的方法。
技术介绍
肝细胞癌是最常见的肝脏肿瘤，在世界范围内肿瘤相关性死亡因素中排名第三，全球每年有超过50万新患者。2012年美国预期有超过2.87万新增病例，20,550预计会死于这一恶性肿瘤。肝细胞癌的主要风险因子包括乙型和丙型肝炎病毒感染以及饮酒造成的肝损伤。如果发现及时尚有治愈的希望，但大多数病例在确诊时均已至晚期无法医治的阶段。2012年，来自俄亥俄州立大学综合癌症中心的研究人员证实一种称作microRNA-122(miR-122)的小分子在防止肝细胞癌变的过程中发挥了重要的“刹车”功能，丧失这一小RNA分子有可能导致肝癌发生，修复该分子则可能减慢肿瘤生长，从而为治疗该疾病指明了一条新的途径。相关研究发表在《临床研究期刊》(JournalofClinicalInvestigation)上。研究者开始开发出一种缺失miR-122的小鼠品系，通过初始的脂肪肝沉积，随后的炎症和肝癌一系列事件，小鼠形成了肝细胞癌。研究人员随后利用了第二种小鼠品系，由于过表达致癌基因MYC这些小鼠会自发形成肝癌。研究人员在肿瘤形成过程中将miR-122传递到动物肝癌内。三周后，这些用分子治疗的小鼠肿瘤既小且少。科学家利用这些研究开发的模型来了解肝脏生物学，也可以用于测试新开发药物对抗包括HCC在内的肝脏疾病的治疗效应。然而，本专利技术的专利技术人发现，肝脏特异的分子miR-122在人和其它非灵长类动物中调控的基因不一样。导致的结果是，老鼠肝癌模型不适于人类肝癌机制的研究，也不适用于肝癌药物的筛选，只有灵长类动物才能作为有效的肝癌动物模型。
技术实现思路
原发性肝癌是全球第五最常被诊断的癌症，同时也是癌症死亡的第二大诱因5，6。许多文献已经报道了TGFβ信号通路在肝肿瘤的转移过程中发挥重要的作用7，8。我们首先估计了miR-122在三种肝细胞系中对内源TGFβ1水平的影响，其中HepG2和Huh7是人的肝癌细胞系，Hepa1-6是小鼠的肝癌细胞系。HepG2含有较低水平的miR-122，而Huh7和Hepa1-6有较高的miR-122表达(见图7)。当用miR-122过表达载体处理HepG2细胞时，细胞表达的TGFβ1下降了54％(图1a和图8)。同时，当用miR-122海绵转染Huh7细胞时，其TGFβ1的量上升了2倍。然而，沉默Hepa1-6细胞的miR-122表达并不能引起TGFβ1的变化，但有趣的是，TGFβR1的表达却上升了2倍。与此相对，人肝癌细胞系的TGFβR1表达量在miR-122或者其海绵作用下并无变化。除此之外，我们发现miR-122的这种正交作用并不仅仅局限于肝细胞(图9)。接下来我们研究了miR-122对下游信号通路组分的抑制作用。在HepG2细胞中过表达miR-122形成一个稳定的细胞系，称作HepG2-122。蛋白质印迹分析表明了在HepG2-122细胞中p-Smad2转变成Smad2的比率下降了50％。在HepG2-122细胞中过表达TGFβ1之后，该转变比率又回复到较高的水平(图1b)。类似地，当miR-122在NIT-1细胞中过表达时，p-Smad2转变成Smad2的比率下降了。同时，我们发现miR-122的抑制效果特异于TGFβ1(图10)。综上所述，这些数据表明了miR-122在人体中能够抑制TGFβ1，但在小鼠中却是抑制TGFβR1。为了验证miR-122是否直接调控人体内的TGFβ1或小鼠中的TGFβR1，我们构建了一组双荧光报告体系，每一组都含有人或者小鼠的3’UTR(图11)。因为人TGFβ1的3’UTR含有多个亚型，我们全部采用最长的亚型进行荧光素酶报告实验9，10。转染含有人的TGFβ1或者小鼠的TGFβR13’UTR的载体会使得荧光量显著下降，但是转入含有人的TGFβR1或者小鼠的TGFβ13’UTR的报告载体则不会引起变化，这些说明了它们的3’UTR上没有靶点位置。(图1d和1e)。因为miR-122的序列是脊椎动物中相同的，我们开始研究在不同物种中的miR-122作用于TGFβ1/TGFβR1的靶点的保守程度。首先，我们实验测定了在恒河猴、猪、大鼠中miR-122是否靶向于TGFβ1/TGFβR1，我们克隆了它们的3’UTR并分别构建入荧光素酶报告载体中(图11)。令人意外的是，我们并没有在这3个物种中的TGFβ1/TGFβR13’UTR中发现任何的miR-122的靶点(图1d，1e)。然而，蛋白质印迹实验却显示miR-122能够在大鼠和猪的细胞系中抑制TGFβR1的表达水平。所以，我们将研究的方向转到了TGFβ1/TGFβR15’UTR和编码区区域(CDS)。我们将5个物种的5’UTR全长克隆并构建成荧光素酶报告载体(图12)。其中仅含有人和恒河猴TGFβ15’UTR的报告载体的荧光亮度能够被miR-122显著降低(图2a和图13)。为了确定精确的靶点位置，我们构建了一系列含有人TGFβ15’UTR截断区域的荧光报告载体，发现当这些载体中含有第4部分片段或者第7部分片段时，能够被miR-122沉默(图2b)。出人意料地，含有第6部分片段的报告载体不受miR-122的影响。我们假设因为第6部分片段有很高的GC比例导致了其形成了比较稳定的RNA二级结构，而接下来的互换与突变实验很好地证明了这点(图14)。序列比对分析和随后的突变实验最终确定了精确的靶点位置，miR-122的3’端能够以一种非经典的方式在该位置形成一个很强的碱基互补配对(图2c)。然后我们对动物系统进化树上的有代表性物种的该靶点位置进行了基因组序列分析。miR-122能够显著的抑制含有海牛TGFβ15’UTR的报告载体的荧光，而该保守5’UTR对应区域的第一位C碱基变成T碱基(图2c，2d，图15)。该保守序列中的第21位的C碱基变成T碱基，同时如果伴随着在第11位和第12位碱基之间插入一个或多个碱基，都会或多或少地影响miR-122对该部分的抑制效果，例如在小鼠、大鼠、狗和猪等物种中。另外在早期的脊椎动物的TGFβ15’UTR中并没有发现这些同源的序列，比如鸟或者鱼，说明该miR-122的靶点位置是在非洲兽类和灵长类的共同祖先时获得的。接下来，我们在TGFβR1CDS区域确定了一组可能为miR-122的靶点，该位置在所有的脊椎动物中高度保守(表S1)11。我们将这些保守的序列分别构建入一个能表达荧光素酶一绿色荧光蛋白融合蛋白的载体中间(图2e)。荧光素酶报告实验证明了再大鼠和猪的TGFβR1CDS区域含有miR-122的靶点，但是在人和猴子中却没有，随后的荧光检测实验也证明了这点(图16)。通过对系统进化树中的代表性物种的miR-122靶点位置的基因组比较分析，我们模拟追踪了进化轨迹。基于简单的推理，我们发现在该靶点的获得与缺失的过程中共发生了三个事件(图2f)。首先，在丛猴与人和狨猴的共同祖先之间出现分化时，一个G变成A的突变(图2f本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建灵长类动物miRNA‑122敲除模型的方法，包括以下步骤：a)将特异性靶向miR‑122的gRNA序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录miR‑122的模板载体；b)将cas9基因的序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录cas9基因的模板载体；c)以步骤a)中的载体为模板进行PCR扩增，得到体外转录miR‑122的gRNA的模板；d)用限制性内切酶将步骤b)中的模板载体线性化，得到体外转录cas9基因的模板；e)以步骤c)和d)中的产物为模板分别进行体外转录，得到特异性靶向miR‑122的gRNA和cas9基因的mRNA；f)将步骤e)中的gRNA和mRNA注射到所述灵长类动物的受精卵细胞中，或者先注射到所述灵长类动物的卵母细胞中，再与所述灵长类动物的精子进行体外受精得到受精卵细胞；g)将步骤f)中的受精卵细胞移植入所述灵长类动物的子宫中，由此产生稳定的敲除miR‑122的灵长类动物子代。

【技术特征摘要】
1.一种构建灵长类动物miRNA-122敲除模型的方法，包括以下步骤：
a)将特异性靶向miR-122的gRNA序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录miR-122的模
板载体；
b)将cas9基因的序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录cas9基因的模板载体；
c)以步骤a)中的载体为模板进行PCR扩增，得到体外转录miR-122的gRNA的模板；
d)用限制性内切酶将步骤b)中的模板载体线性化，得到体外转录cas9基因的模板；
e)以步骤c)和d)中的产物为模板分别进行体外转录，得到特异性靶向miR-122的gRNA和cas9
基因的mRNA；
f)将步骤e)中的gRNA和mRNA注射到所述灵长类动物的受精卵细胞中，或者先注射到所述
灵长类动物的卵母细胞中，再与所述灵长类动物的精子进行体外受精得到受精卵细胞；
g)将步骤f)中的受精卵细胞移植入所述灵长类动物的子宫中，由此产生稳定的敲除miR-122
的灵长类动物子代。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述灵长类动物为猴。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述猴为恒河猴、猕猴、豚尾猴、食蟹猴或绒猴。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)中所述模板载体含有特异性靶向miR-122
的gRNA序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)中所述模板载体含有cas9基因的序列。
6.一种构建灵长类动物miRNA-122敲除模型的方法，包括以下步骤：
a)将特异性靶向miR-122的TALEN序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录特异性靶向
miR-122的TALEN的模板载...

【专利技术属性】
技术研发人员：席建忠，孙常宏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11