一种T1R3基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种T1R3基因过表达慢病毒载体、T1R3慢病毒及其构建方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术通过基因重组技术，以pLVX‑Puro慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R3基因，得到T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX‑Puro‑T1R3。使用慢病毒包装质粒pRSV‑Rev、pMDlg‑pRRE和pMD2.G对T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX‑Puro‑T1R3进行包装，通过转染HEK293细胞，得到T1R3慢病毒。本发明专利技术所构建的T1R3基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高，能特异、持续、高效地促进T1R3基因在宿主细胞中的稳定表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种T1R3基因过表达慢病毒载体、T1R3慢病毒及其构建方法。
技术介绍
味觉功能学研究表明，甜味主要由味觉细胞的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors，GPCRs)家族所介导，即味觉受体第1家族(taste receptor family 1 members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受体，它们以T1R2+T1R3异二聚体的形式发挥作用，共同对甜味进行识别。甜味受体在结合配体后，下游G蛋白被激活，其α亚基与β、γ亚基分离，Gα亚基进入胞浆进而激活下游效应器，最终导致细胞内钙离子浓度升高。因此，通过构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。构建共表达人T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，需要使用到带有人T1R3基因的过表达载体。现有的方法采用的是将整合有T1R3基因的质粒载体通过脂质体对宿主细胞进行转染，但是脂质体转染质粒载体的转染效率较低，要构建能稳定共表达T1R2、T1R3和Gα三种基因的细胞系成功率也较低。因此，如何提高T1R3基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种T1R3基因过表达慢病毒载体、T1R3慢病毒及其构建方法，该方法所构建的慢病毒载体，转染效率高，并能将T1R3基因整合到宿主细胞的基因组中，因此能特异、持续、高效地促进T1R3基因在宿主细胞中的稳定表达。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种T1R3基因过表达慢病毒载体，以慢病毒pLVX-Puro慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R3基因，得到T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX-Puro-T1R3。本专利技术还提供pLVX-Puro-T1R3慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：步骤(1)，人工合成T1R3基因；步骤(2)，以下列PCR扩增引物进行T1R3基因的PCR扩增：所述的PCR扩增引物为：T1R3-F：agattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg；T1R3-R：agatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg；步骤(3)，用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对T1R3基因的PCR产物和慢病毒载体pLVX-Puro进行双酶切；步骤(4)，用T4DNA连接酶将酶切的得到的线性化的T1R3基因和慢病毒载体连接，将得到的连接液转化DH5α感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX-Puro-T1R3；其中，步骤(4)PCR鉴定采用的PCR扩增引物与步骤(2)所采用的PCR扩增引物相同。步骤(4)测序所用引物为：CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；PGK：cattctgcacgcttcaaaag；T1R3seq1：accttcccctccttcttc；T1R3seq2：ctctgtctacgcagctgtg。本专利技术另外提供一种T1R3慢病毒的构建方法，采用上述T1R3基因过表达慢病毒载体，方法是：使用慢病毒包装质粒pRSV-Rev、pMDlg-pRRE和pMD2.G对T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX-Puro-T1R3进行包装。，通过转染HEK293细胞，得到T1R3慢病毒。本专利技术还要求保护上述T1R3慢病毒的构建方法构建得到的T1R3慢病毒。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术所构建的T1R3基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80％～90％，比起现有的质粒转染法转染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能将T1R3基因整合到宿主细胞的基因组中，因此使用该方法能特异、持续、高效地促进基因T1R3在宿主细胞中的稳定表达。过表达T1R3基因的细胞可用于构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。附图说明图1是pLVX-Puro慢病毒表达载体图谱；图2是pRSV-Rev慢病毒包装质粒图谱；图3是pMDlg-pRRE慢病毒包装质粒图谱；图4是pMD2.G慢病毒包装质粒图谱。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。主要实验试剂及厂家：大肠杆菌菌株DH5α(Invitrogen)胎牛血清FBS(Invitrogen)胰蛋白酶(Invitrogen)DMEM完全培养基(含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)(Invitrogen)限制性内切酶(Fermentas)T4DNA连接酶(NEB公司)质粒DNA提取试剂盒(Axygen公司)制备感受态试剂盒(BIOSCIENCES)PrimeSTAR Max Premix(2X)(Takara)逆转录酶MuLV(NEB)RNAnase抑制剂(NEB)SYBR Green qPCR Master Mix(2X)(Thermo Scientific)pLVX-Puro、pRSV-Rev、pMDlg-pRRE和pMD2.G，均可商购于上海比昂生物医药科技有限公司。实施例1：T1R3基因过表达慢病毒载体构建。1、人工合成T1R3基因，其DNA如SEQ ID NO.1所示。2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的T1R3基因为模板，通过如表1所示引物进行的PCR扩增：表1PCR反应体系与条件如表2：表2试剂体积模板1μL上游引物T1R3-F(10μM)1μL下游引物T1R3-R(10μM)1μLPrimeSTAR Max(2x)10μLddH2O7μL总体积20μLPCR程序如表3：表33、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小是否与预期一致，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的片段条带，用DNA回收试剂盒回收纯化；4、用EcoRI和BamHI限制性内切酶分别对T1R3基因的PCR产物和慢病毒表达载体pLVX-Puro进行双酶切(于37℃酶切3h)，反应体系和反应条件如表4：表45、琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的T1R3基因片段条带和线性化的慢病毒载体，用胶回收试剂盒回收DNA；6、用T4 DNA连接酶于16℃水浴下，将两种酶切产物进行连接，过夜。反应如表5：表5试剂体积10X T4 DNA连接酶buffer2μLT4 DNA连接酶(400U/μL)1μLT1R3基因片段10μL线性化的慢病毒表达载体4μLddH2O3μL总体积20μL7、转化感受态细胞：从-80℃冰箱取出1管100μL DH5α感受态细胞，放冰上解冻(解冻至无冰状态)后取10μL上述步骤6中的连接产物加到感受态细胞中混匀，静置30min，42℃水浴热激1min，冰上静置2min。加LB液体培养基500μL，37℃振荡培养1小时。3000rpm离心5min，留100μl左右上清液混匀细菌后涂到LB平板上，3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种T1R3基因过表达慢病毒载体，其特征在于以慢病毒pLVX‑Puro慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R3基因，得到T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX‑Puro‑T1R3。

【技术特征摘要】
1.一种T1R3基因过表达慢病毒载体，其特征在于以慢病毒pLVX-Puro慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R3基因，得到T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX-Puro-T1R3。2.权利要求1所述的pLVX-Puro-T1R3慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），人工合成T1R3基因；步骤（2），以下列PCR扩增引物进行T1R3基因的PCR 扩增：所述的PCR扩增引物为：T1R3-F：agattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg；T1R3-R：agatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg；步骤（3），用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对T1R3基因的PCR 产物和慢病毒载体pLVX-Puro进行双酶切；步骤（4），用T4 DNA连接酶将酶切的得到的线性化的T1R3基因和慢病毒载体连接，将得到的连接液转化DH5α感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定阳性的克...

【专利技术属性】
技术研发人员：夭建华，朱洲海，李雪梅，缪明明，管莹，高茜，米其利，唐萍，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53