一种Gα基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种Gα基因过表达慢病毒载体、Gα慢病毒及其构建方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术通过基因重组技术，以pLVX‑IRES‑mCherry慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有Gα基因，得到Gα基因过表达慢病毒载体pLVX‑IRES‑mCherry‑Gα。使用慢病毒包装质粒pRSV‑Rev、pMDLg‑pRRE和pMD2.G对Gα基因过表达慢病毒载体pLVX‑IRES‑mCherry‑Gα进行包装，通过转染HEK293细胞，得到Gα慢病毒。本发明专利技术所构建的Gα基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高，能特异、持续、高效地促进Gα基因在宿主细胞中的稳定表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种Gα基因过表达慢病毒载体、Gα慢病毒及其构建方法。
技术介绍
味觉功能学研究表明，甜味主要由味觉细胞的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors，GPCRs)家族所介导，即味觉受体第1家族(taste receptor family 1 members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受体，它们以T1R2+ T1R3异二聚体的形式发挥作用，共同对甜味进行识别。甜味受体在结合配体后，下游G蛋白被激活，其α亚基与β、γ亚基分离，Gα亚基进入胞浆进而激活下游效应器，最终导致细胞内钙离子浓度升高。因此，通过构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。构建共表达人T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，需要使用到带有人Gα基因的过表达载体。现有的方法采用的是将整合有Gα基因的质粒载体通过脂质体对宿主细胞进行转染，但是脂质体转染质粒载体的转染效率较低，要构建能稳定共表达T1R2、T1R3和Gα三种基因的细胞系成功率也较低。因此，如何提高Gα基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种Gα基因过表达慢病毒载体、Gα慢病毒及其构建方法，该方法所构建的慢病毒载体，转染效率高，并能将Gα基因整合到宿主细胞的基因组中，因此能特异、持续、高效地促进Gα基因在宿主细胞中的稳定表达。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种Gα基因过表达慢病毒载体，以慢病毒pLVX-IRES-mCherry慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有Gα基因，得到Gα基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry-Gα。本专利技术还提供pLVX-IRES-mCherry-Gα慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：步骤（1），人工合成Gα基因；步骤（2），以下列PCR扩增引物进行Gα基因的PCR 扩增：所述的PCR扩增引物为：Gα-F：agattctagagctagcaccaccatggatggcccgctcgctg；Gα-R：agatccttgcggccgctcagaagagcccacagtc；步骤（3），用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对Gα基因的PCR 产物和慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry进行双酶切；步骤（4），用T4 DNA连接酶将酶切的得到的线性化的Gα基因和慢病毒载体连接，将得到的连接液转化DH5α感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的Gα基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry-Gα；其中，步骤（4）PCR鉴定采用的PCR扩增引物与步骤（2）所采用的PCR扩增引物相同。步骤（4）测序所用引物为：CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；IRES-R：cctcacattgccaaaagacg。本专利技术另外提供一种Gα慢病毒的构建方法，采用上述Gα基因过表达慢病毒载体，方法是：使用慢病毒包装质粒pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G对Gα基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry-Gα进行包装。，通过转染HEK293细胞，得到Gα慢病毒。本专利技术还要求保护上述Gα慢病毒的构建方法构建得到的Gα慢病毒。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术所构建的Gα基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80%~90%，比起现有的质粒转染法转染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能将Gα基因整合到宿主细胞的基因组中，因此使用该方法能特异、持续、高效地促进基因Gα在宿主细胞中的稳定表达。过表达Gα基因的细胞可用于构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。附图说明图1是pLVX-IRES-mCherry慢病毒表达载体图谱；图2是pRSV-Rev慢病毒包装质粒图谱；图3是pMDLg-pRRE慢病毒包装质粒图谱；图4是pMD2.G慢病毒包装质粒图谱。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。主要实验试剂及厂家：大肠杆菌菌株DH5α（Invitrogen）胎牛血清FBS（Invitrogen）胰蛋白酶（Invitrogen）DMEM完全培养基（含10%FBS、100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素）（Invitrogen）限制性内切酶（Fermentas）T4 DNA连接酶（NEB公司）质粒DNA提取试剂盒（Axygen公司）制备感受态试剂盒（BIOSCIENCES）PrimeSTAR Max Premix(2X) （Takara）逆转录酶MuLV（NEB）RNase 抑制剂（NEB）Maxima® SYBR Green qPCR Master Mix (2X) （Thermo Scientific）pLVX-IRES-mCherry、pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G，均可商购于上海比昂生物医药科技有限公司。实施例1：Gα基因过表达慢病毒载体构建。1、人工合成Gα基因，其DNA如SEQ ID NO.1所示。2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的Gα基因为模板，通过如表1所示引物进行的PCR 扩增：表1PCR反应体系与条件如表2：表2PCR程序如表3：表33、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小是否与预期一致，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的片段条带，用DNA回收试剂盒回收纯化；4、用EcoRI和BamHI 限制性内切酶分别对Gα基因的PCR 产物和慢病毒表达载体pLVX-IRES-mCherry进行双酶切（于37℃酶切3h），反应体系和反应条件如表4：表45、琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的Gα基因片段条带和线性化的慢病毒载体，用胶回收试剂盒回收DNA；6、用T4 DNA连接酶于16℃水浴下，将两种酶切产物进行连接，过夜。反应如表5：表57、转化感受态细胞：从-80℃冰箱取出1管100μL DH5α感受态细胞，放冰上解冻（解冻至无冰状态）后取10μL 上述步骤6中的连接产物加到感受态细胞中混匀，静置30min，42℃水浴热激1min，冰上静置2min。加LB液体培养基500μL，37℃振荡培养1小时。3000rpm 离心5min，留100μl左右上清液混匀细菌后涂到LB平板上，37℃倒置培养过夜。8、挑取数个菌落，做菌落PCR检测转化子，反应体系和条件见步骤2；9、将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行测序验证，测序引物如表6：表6实施例2：Gα慢病毒包装1、用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，细胞密度为5×106时；重新接种于含有25 mL 含10%（v/v）FBS的无抗生素DMEM培养基直径为15cm的细胞培养皿中，37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养；2、制备慢病毒包装系统本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Gα基因过表达慢病毒载体，其特征在于以慢病毒pLVX‑IRES‑mCherry慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有Gα基因，得到Gα基因过表达慢病毒载体pLVX‑IRES‑mCherry‑Gα。

【技术特征摘要】
1.一种Gα基因过表达慢病毒载体，其特征在于以慢病毒pLVX-IRES-mCherry慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有Gα基因，得到Gα基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry-Gα。2.权利要求1所述的pLVX-IRES-mCherry-Gα慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），人工合成Gα基因；步骤（2），以下列PCR扩增引物进行Gα基因的PCR 扩增：所述的PCR扩增引物为：Gα-F：agattctagagctagcaccaccatggatggcccgctcgctg；Gα-R：agatccttgcggccgctcagaagagcccacagtc；步骤（3），用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对Gα基因的PCR 产物和慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry进行双酶切；步骤（4），用T4 DNA连接酶将酶切的得到的线性化的Gα基因和慢病毒载体连接，将得到的连接液转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：夭建华，朱洲海，李雪梅，缪明明，米其利，管莹，高茜，唐萍，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53