Alb‑uPA‑teton慢病毒载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种Alb‑uPA‑teton慢病毒载体及其制备方法和应用，其中Alb‑uPA‑TetOn慢病毒载体含有反向连接的白蛋白启动子PAlb和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，所述白蛋白启动子PAlb调控四环素反式激活子rtTA表达，所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA由PTight启动子调控表达；该载体具备独立建系的能力，在NOD小鼠体内检测出uPA的表达。

Alb uPA Teton vector lentivirus and preparation method and application thereof

The present invention relates to a Alb uPA Teton lentiviral vector and preparation method and application thereof, wherein Alb uPA TetOn lentiviral vector containing albumin reverse connection promoter PAlb and urokinase type plasminogen activator gene uPA, the albumin promoter PAlb regulation of tetracycline transactivator promoter rtTA expression, the urokinase type plasminogen activator gene uPA expression controlled by PTight promoter; the carrier has the ability to independent lines, in the mice of NOD to detect the expression of uPA.

【技术实现步骤摘要】
Alb-uPA-teton慢病毒载体及其制备方法和应用
本专利技术属于基因功能领域，具体涉及Alb-uPA-teton慢病毒载体，还涉及该载体的制备方法和应用。
技术介绍
除人和灵长类动物外，人肝炎病毒并不存在天然的小动物感染宿主，这严重阻碍了对人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物的研究。目前只有黑猩猩是研究人肝炎病毒感染最好的体内实验模型，但使用受保护的稀有灵长类动物受到伦理学及经费等诸多限制。因此建立廉价易得的小动物模型是亟待解决的难题。近年发展起来的能携带人肝组织的小鼠动物模型为肝炎病毒感染机制和抗病毒药物研究提供了良好的平台。经研究发现尿激酶型纤溶蛋白酶(urokinaseplasminogenactivator，uPA)小鼠肝损伤模型，是携带人肝组织的理想小鼠动物模型。但是通过转基因方法获得的尿激酶型纤溶蛋白酶转基因小鼠，子代新生死亡率高、筛选难度大，大大阻碍了人嵌合肝小鼠模型的构建、推广和使用。公开号为CN102628063A的中国专利公开了PAlb-uPA慢病毒载体，该载体在小鼠细胞水平能够过量表达尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA，但是经过大量动物原核注射实验验证，由该载体获得转基因小鼠的子代(founder0)未能筛选出携带目的片段的转基因小鼠，即在小鼠体内不能表达目的基因的生物学功效。产生的原因可能如下：(1)构建的携带目的基因的慢病毒质粒，经原位注射到受精卵转入到小鼠体内后发生了溃解，不能完整或者完全重新随机地插入到小鼠基因组中，致使目的片段无法表达；(2)构建的携带目的基因的慢病毒质粒，经小鼠受精卵细胞原位注射，随机方式整合到小鼠基因组中，目的片段排列顺序发生了改变，不能按照原来设计的要求表达目的片段的生物学效能；(3)可能排列顺序并没有发生改变，只是目的片段之间的排列受到基因组空间结构的影响，干扰了目的片段的表达。因此，急需对现有的pAlb-uPA慢病毒载体进行改进，能够获得子代携带目的片段的转基因小鼠，从而制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，提供携带人肝组织的受体小鼠。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种具有独立建系能力的Alb-uPA-TetOn慢病毒载体；本专利技术的目的之二在于提供Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供Alb-uPA-TetOn慢病毒载体在制备转基因小鼠中的应用；本专利技术的目的之四在于提供制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：Alb-uPA-TetOn慢病毒载体，所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体含有反向连接的白蛋白启动子PAlb和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，所述白蛋白启动子PAlb调控四环素反式激活子rtTA表达，所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA由PTight启动子调控表达；所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQIDNO.34所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQIDNO.33所示；所述四环素反式激活子rtTA的核苷酸序列如SEQIDNO.31所示；所述PTight启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.32所示。本专利技术中，所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的白蛋白启动子PAlb和PTight启动子的5’端连接有绝缘子。本专利技术中，终止尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的终止子为兔β球蛋白PolyA，终止四环素反式激活子rtTA表达的终止子为牛生长激素基因polyA。最优选的，所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的核苷酸序列如SEQIDNO.26所示。2、所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：(1)将克隆尿激酶型纤溶蛋白酶基因uPA、兔β球蛋白PolyA和牛生长激素基因polyA通过SLIC技术连接到经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的pTRETight质粒上，得到1969-pTRE-uPA-PA过渡载体；(2)将白蛋白启动子Alb和四环素反式激活子rtTA通过SLIC技术连接到经内切酶AscI酶切的1969-pTRE-uPA-PA过度载体上，得1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb过度载体；(3)将1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb过度载体经Xhol和Sacll酶切后回收5549bp片段，然后将回收产物与带Xhol和Sacll酶切粘性末端的绝缘子连接，即得Alb-uPA-TetOn慢病毒载体。优选的，尿激酶型纤溶蛋白酶基因uPA的克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列为引物进行扩增获得；兔β球蛋白PolyA克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示序列为引物进行扩增获得；牛生长激素基因polyA克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示序列为引物进行扩增获得；白蛋白启动子Alb克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示序列为引物进行扩增获得；四环素反式激活子rtTA克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示序列为引物进行扩增获得。3、所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体在制备转基因小鼠中的应用。4、所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体在制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了Alb-uPA-TetOn慢病毒载体，该载体通过在现有PAlb-uPA慢病毒载体上进行改进，将目的片段pAlb与uPA进行反向连接，并在整个目的片段的两端分别加上绝缘子，以阻断因随机插入位点不同引起的相互影响，该载体具有独立建系能力，将Alb-uPA-TetOn慢病毒载体原位注射后慢病毒质粒能正常表达uPA生物学活性，因此能够用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型；对人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物研究具有重要意义。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为1969-pTRE-uPA-PA载体酶切验证结果(图中1、2、3、4分别为挑选出来的四个阳性克隆；DL表示markerDL2000；T表示markerT14)。图2为1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb载体PCR检测图(图中DL表示MarkerDL2000，1-1，1-2，1-3，1-4，1-6，1-7，1-8，2-1，2-2，2-3，2-4，2-5，2-6，3-1，3-2，3-3，3-4，3-7，3-8，4-2，4-3，4-4，4-7和4-8分别表示不同的阳性单克隆，目的片段530bp)。图3为1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb载体分别用EcoRl、ApaLl和Sacl进行酶切结果(1-4，1-8表示不同菌株质粒，DL表示markerDL2000；T表示markerT14)。图4表示1969-Alb-uPA-teton-final质粒图谱。图5为1969-Alb-uPA-teton-final质粒PCR检测结果(图中DL表示MarkerDL2000，1-1，1-5，1-6，2-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
Alb‑uPA‑TetOn慢病毒载体，其特征在于：所述Alb‑uPA‑TetOn慢病毒载体含有反向连接的白蛋白启动子PAlb和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，所述白蛋白启动子PAlb调控四环素反式激活子rtTA表达，所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA由PTight启动子调控表达；所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；所述四环素反式激活子rtTA的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；所述PTight启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

【技术特征摘要】
1.Alb-uPA-TetOn慢病毒载体，其特征在于：所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体含有反向连接的白蛋白启动子PAlb和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，所述白蛋白启动子PAlb调控四环素反式激活子rtTA表达，所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA由PTight启动子调控表达；所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQIDNO.34所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQIDNO.33所示；所述四环素反式激活子rtTA的核苷酸序列如SEQIDNO.31所示；所述PTight启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.32所示。2.根据权利要求1所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体，其特征在于：所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的白蛋白启动子PAlb和PTight启动子的5端连接有绝缘子。3.根据权利要求1所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体，其特征在于：终止尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的终止子为兔β球蛋白PolyA，终止四环素反式激活子rtTA表达的终止子为牛生长激素基因polyA。4.根据权利要求1所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体，其特征在于：所述白蛋白启动子PAlb的5‘端还连接有小鼠白蛋白增强子。5.根据权利要求2所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体，其特征在于：所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的核苷酸序列如SEQIDNO.26所示。6.权利要求1～5任一项所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将克隆尿激酶型纤溶蛋白酶基因uPA、兔β球蛋白PolyA和牛生长激素基因polyA通过SLIC技术连接到经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切...

【专利技术属性】
技术研发人员：白家驷，毛青，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50