一种巨噬细胞靶向载体系统及其制备技术方案

本发明专利技术属于制药领域，公开了一种巨噬细胞靶向载体的合成以及基因递送系统制备方法。巨噬细胞靶向载体为甘露糖化精蛋白，正电性的甘露糖化精蛋白荷载负电性的核酸形成一种荷正电的纳米粒子。其中甘露糖修饰的精蛋白是由甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐经还原胺化反应制备。与非病毒基因载体精蛋白相比，甘露糖化精蛋白不仅具有核定位功能且具有巨噬细胞靶向性，能够提高精蛋白在巨噬细胞中的基因转染介导效率。本发明专利技术制备方法简单，工艺成熟，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于制药领域，具体涉及一种巨噬细胞靶向载体系统及其制备。
技术介绍
随着基因治疗技术的发展，核酸疫苗受到越来越多的关注，因其能够针对抗原诱导特异性细胞和体液免疫应答。众所周知，基因治疗过程中，基因必须进入细胞核内才能发挥作用，然而核膜是比细胞膜特异性和选择性更高的最后一道屏障。因此，有必要利用合适的递送载体保护基因免受核酸酶的降解并能穿过细胞内多层屏障到达核。近年来，许多阳离子聚合物如壳聚糖、聚赖氨酸等被用于基因递送。然而，这些阳离子聚合物介导基因的转染效率仍有待提高。精蛋白是从雄鱼的精细胞中分离出来的富含精氨酸的多肽。在成熟雄鱼精细胞中，精蛋白能够与精子DNA凝聚形成紧密结构，递送精子DNA到卵细胞核。精蛋白具有4个可能的核定位信号肽的区域，这些区域为4至6个精氨酸重复序列，因此这些结构使精蛋白首先具有核定位的功能，能够介导经由核孔复合物的核质转运，其次强正电性的碱性氨基酸能够与带负电的DNA通过静电作用结合形成紧密的纳米级二元复合物，保护基因免受核酸酶降解，并通过胞吞途径提高细胞对基因的摄取从而提高疫苗的免疫原性。精蛋白本身具有很好的安全性，已被US FDA批准作为抗肝素药用于临床。然而，作为基因疫苗递送载体，精蛋白缺乏细胞特异性，难以将核酸疫苗靶向递送至特异性细胞。DNA疫苗经接种后，首先将被递送至抗原递呈细胞内，在此基因编码表达抗原并被递呈，激发机体系统免疫。巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞表面大量表达甘露糖受体，采用甘露糖作为配体修饰精蛋白，通过糖类识别机制，借助受体介导的巨噬细胞主动靶向，增加巨噬细胞对疫苗的摄取，提高疫苗的免疫原性。KR 20070029982A公布了一种直接用对异硫氰酸苯基甘露吡喃糖苷与壳聚糖进行反应，制得甘露糖化壳聚糖。但对异硫氰酸苯基甘露吡喃糖苷价格昂贵，实用性低，且经此路线合成的甘露糖化壳聚糖分子结构中，甘露糖和壳聚糖之间的架桥为N-苯基硫脲基。CN 102477107A公布了一种甘露糖化壳聚糖的简便制备方法，是以甘露糖和烯丙醇为原料，经过糖苷化反应，糖羟基的乙酰化反应，丙烯基的氧化反应，以及脱乙酰化反应后制得甲酰甲基 甘露吡喃糖苷，该中间体活性较高，与壳聚糖经还原胺化反应制得甘露糖化壳聚糖，该方法反应条件温和可控，产品得率高。因此，本专利技术选用甲酰甲基甘露吡喃糖苷对精蛋白进行甘露糖配体修饰，在不影响其本身的核定位功能和安全性的前提下，使其同时具有巨噬细胞靶向性，成为多功能且更有效的基因疫苗递送载体。到目前为止，尚未报道对精蛋白进行甘露糖修饰并用于递送核酸物质的相关文献或专利。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术首次对精蛋白进行甘露糖修饰，通过甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐经由还原胺化反应制得甘露糖化精蛋白，该化合物具有强正电性，能够在水性介质中与荷负电的核酸物质通过静电结合形成结构致密的纳米粒。因此，本专利技术的目的是提供一种巨噬细胞靶向载体系统。该载体系统为甘露糖化精蛋白与核酸物质形成的纳米粒。甘露糖化精蛋白分子结构中的甘露糖配体能够与巨噬细胞表面的甘露糖受体结合，通过糖类识别机制，借助受体介导的巨噬细胞主动靶向作用，增加巨噬细胞对纳米粒子的摄取，提高基因物质的转染率，以解决现有的精蛋白载体缺乏细胞特异性的问题，提高核酸疫苗的免疫原性。本专利技术提供的一种巨噬细胞靶向载体系统主要是由甘露糖化精蛋白与核酸物质形成的纳米粒。其中，甘露糖化精蛋白是由甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐经还原胺化反应制得。所述精蛋白为鲑鱼精蛋白，分子量为5100Da。所述甘露糖化精蛋白的结构为：所述甘露糖化精蛋白分子结构中，甘露糖通过-CH2-CH2-与精蛋白桥接。本专利技术的另一目的是提供一种制备前述纳米粒的方法，具体包括下列步骤：1)甘露糖化精蛋白的合成：将甲酰甲基甘露吡喃糖苷和精蛋白硫酸盐溶于蒸馏水中，室温下搅拌至完全溶解，向反应液中加入还原胺化试剂三乙酰氧基硼氢化钠，室温下搅拌24～48h，纯化即得甘露糖化精蛋白。合成路线如下：2)甘露糖化精蛋白载基因纳米粒的制备：将核酸溶液在搅拌下逐滴加入等体积的前述甘露糖化精蛋白溶液中，室温静置30min，荷正电的甘露糖化精蛋白与荷负电的核酸物质通过静电结合形成稳定的纳米粒。所述的制备方法，其中甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐的摩尔比为8.5∶1～16∶1。摩尔比过低时，甘露糖的取代度过低，使主动靶向效率降低；摩尔比过高时，甘露糖取代度过高，精蛋白分子结构中参与反应的氨基较多，用于压缩基因的氨基减少，影响制得纳米粒的稳定性。所述的制备方法，其中甲酰甲基甘露吡喃糖苷与三乙酰氧基硼氢化钠的摩尔比为1∶10。所述的制备方法，其中甘露糖化精蛋白的纯化方法可为透析法。1000Da截留分子量的透析袋4℃透析36～48h，滤去不溶物，滤液冻干即得。所述的制备方法，其中甘露糖化精蛋白的纯化方法可为乙醇沉淀法。向反应液中加入10～20倍体积的-20℃预冻的无水乙醇，使甘露糖化精蛋白析出，用无水乙醇洗涤沉淀3遍，12000rpm冷冻离心，真空干燥或真空冷冻干燥即得。甘露糖化精蛋白的纯化方法优选透析法。所述的制备方法，其中甘露糖化精蛋白与核酸物质的制备N/P比为0.8∶1～8∶1，优选的N/P比为2∶1～8∶1。所述的核酸物质选自DNA疫苗，RNA疫苗的一种。 所述的一种巨噬细胞靶向载体系统对核酸物质的包封率为90％～100％。与现有技术相比，本专利技术至少具有如下优点：1)与精蛋白压缩DNA得到的纳米粒相比，本专利技术的载体对巨噬细胞具有良好的靶向性，可通过特异性糖类识别机制增加巨噬细胞对核酸疫苗的摄取，提高基因的转染效率，增加核酸疫苗的免疫原性。2)本专利技术甘露糖修饰过程并未影响精蛋白的核定位功能，修饰后的精蛋白仍然具有良好的核定位性能，能够进一步提高基因的转染效率。3)本专利技术所述甘露糖化精蛋白分子结构中，甘露糖与精蛋白通过-CH2-CH2-桥接，精蛋白经修饰后细胞毒性并未增加，生物相容性良好。4)本专利技术制备方法简单，工艺成熟，反应条件温和可控，合成反应收率为47％～65％，可实现放大生产，具有广阔的应用前景。附图说明图1精蛋白(PS)与甘露糖化精蛋白(MPS)的核磁图谱图2MPS的红外图谱图3MPS/pDNA纳米粒的细胞毒性评价图4MPS/pDNA纳米粒的胞内定位图5MPS/pGL-3纳米粒的体外转染具体实施方式以下具体实施例是对本专利技术的进一步说明，但下述仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。实施例1：甘露糖化精蛋白的合成与表征将1-α-甲酰甲基-甘露吡喃糖苷(50mg，0.23mM)和精蛋白硫酸盐(PS，113.6mg，0.02mM)加入15mL蒸馏水中，室温下搅拌至完全溶解。向反应溶液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(474.75mg，2.3mM)，室温下搅拌48h(TLC监测反应进程，甲醇∶三乙胺∶水＝3∶2∶1，v/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巨噬细胞靶向载体系统，其特征在于，它主要是由甘露糖化精蛋白与核酸形成的纳米粒，其中甘露糖化精蛋白是由甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐经还原胺化反应制得。

【技术特征摘要】
1.一种巨噬细胞靶向载体系统，其特征在于，它主要是由甘露糖化精蛋白与核酸形成的纳米
粒，其中甘露糖化精蛋白是由甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐经还原胺化反应制
得。
2.根据权利要求1所述的一种巨噬细胞靶向载体系统，其特征在于，所述精蛋白为鲑鱼精蛋
白，分子量为5100Da。
3.根据权利要求1所述的一种巨噬细胞靶向载体系统，其特征在于，所述甘露糖化精蛋白的
结构为：
4.根据权利要求3所述的一种甘露糖化精蛋白，其特征在于，所述甘露糖与精蛋白通过
-CH2-CH2-桥接。
5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗莉，曾昭雁，戴爽，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32