一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法，该慢病毒载体通过将含有CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体基因的穿梭表达载体与辅助包装质粒共转染293T细胞后，重组收获及浓缩即形成表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体。本发明专利技术表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备方法具有简单易行，耗时短，重复性高，所生产的慢病毒具有很高的感染效率，可高效表达目的基因，且很少引发机体的免疫反应，应用范围十分广泛。

【技术实现步骤摘要】
一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法
：本专利技术涉及医学病毒学
，具体涉及一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法。
技术介绍
：淋巴T细胞是构成细胞免疫的主要成分，而利用基因工程使T细胞表达嵌合抗原受体能使T细胞转化成为具有特异性杀伤肿瘤细胞的效应细胞，是一种有前景的肿瘤免疫治疗策略。嵌合性抗原受体应用的关键是确定一种肿瘤相关抗原，这种抗原具有在肿瘤细胞表面过表达或高表达，而在正常组织无表达或低表达。CD19是表达于B淋巴细胞及滤泡树突状细胞的表面蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，位于16号染色体短臂上(16p11.2)，编码556个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量95KD。细胞外有N端及两个C2-Ig区，一个跨膜区，细胞内有C端及含9个酪氨酸残基的高度保守功能区，CD19在早期B细胞的发育中扮演重要的角色，所有的急性白血病都表达CD19。CD20是一种磷酸化蛋白质分子，分子质量约为35kD，属于4次跨膜的蛋白质超家族。它表达于90％以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞，而在造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体，其特征在于：所述慢病毒载体是通过将含有CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体基因的穿梭表达载体与辅助包装质粒共转染293T细胞后，重组收获及浓缩即形成表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体。

【技术特征摘要】
1.一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体，其特征在于：所述慢病毒载体是通过将含有CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体基因的穿梭表达载体与辅助包装质粒共转染293T细胞后，重组收获及浓缩即形成表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体。2.根据权利要求1所述的表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：293T细胞的准备a.从初始细胞库中复苏293T细胞；b.将复苏的293T细胞悬浮于10％FBSDMEM培养基中，接种于T75培养瓶中置于37℃条件下，5％CO2孵育箱内进行培养；c.将培养的293T细胞每隔3～4天进行传代扩增培养一次；S2：慢病毒CD19和CD20表达质粒与辅助包装质粒的共转染a.将所述传代扩增的293T细胞于CellStack培养盘中，2天后当细胞覆盖培养盘面积的80％时开始转染；b.准备共转染混合物，根据CellStack培养盘的用量或转染的细胞量的比例进行扩大或缩减转染，备用；c.按照顺序依次加入含有CD19和CD20基因的慢病毒载体和辅助包装质粒，并将所述辅助包装质粒溶于pH7.9的TE缓冲液中；d.再加入CaCl2和pH7.2的2XHEPES生理缓冲液混匀后，置于室温下5min～30min；e.移去培养盘中原有的培养基，加入所述备用的共转染混合物和含有2％FBS的DMEM培养基，并将培养盘置于37℃，5％CO2孵育箱内培养2～3h；f.移除共转染混合物后，加入含有丁酸盐的2％FBS的DMEM培养基中，再将培养盘置于37℃，5％CO2孵育箱进行培养72h；S3：重组慢病毒收获及浓缩a.收获上述培养72h后的重组慢病毒上清，即得粗制慢病毒；b.将收获的粗制慢病毒上清经过滤器过滤，以清除细胞杂质；c.于16℃，50000Xg条件下超离心120min后，弃掉上清，再将离心管倒置晾干；d.将上述沉淀溶于1XPBS中，离心1000pm，1～2min除去不溶物，所获的上清即为浓缩后的表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱分禄，刘晓明，
申请(专利权)人：刘晓明，
类型：发明
国别省市：宁夏,64