一种基于氧化硅纳米颗粒构建多功能基因治疗载体及药物载体的方法技术

本发明专利技术属于非病毒基因载体及药物载体制备技术领域，具体涉及以不同形貌、尺寸的氧化硅纳米颗粒为基质，利用表面修饰功能化氧化硅纳米颗粒，以原子转移自由基聚合(ATRP)法构建多功能载体。本发明专利技术所采用表面修饰手段、聚合反应温和，易于调控，可根据需要制备出多种不同聚合度的多功能基因治疗载体及药物载体，并且其储存稳定性好。该多功能基因治疗载体及药物载体在HepG2、COS7、293、C6、Hela等细胞中具有高于国际上“金标”PEI的转染效率，并且细胞毒性远低于高分子线性PDMAEMA。此外，氧化硅纳米颗粒形貌易于调控，可根据不同细胞系设计特殊形貌及尺寸，并且氧化硅纳米颗粒的多孔结构可以装载多种不同药物分子，为新型基因/药物的开发打下了良好的实验基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于非病毒基因载体及药物载体
，具体涉及以氧化硅纳米颗粒为基质，利用表面修饰功能化氧化硅纳米颗粒，以原子转移自由基聚合(ATRP)法构建多功能基因治疗载体及药物载体的方法。
技术介绍
随着癌症以及其它基因类疾病发病率的升高，基因治疗在癌症以及其它疾病治疗中的应用引起人们的广泛关注。基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的，即将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。目前基因治疗在攻克人类癌症、遗传疾病以及心血管等重大疾病方面起到举足轻重的作用。选择合适的基因载体和药物基因复合，使目的基因能够在靶细胞中获得安全、高效、可控且稳定的表达是基因治疗的关键问题之一。基因载体作为基因导入细胞的工具，功能为将目的基因送至宿主细胞，跨过细胞膜及细胞外基质，将基因导入细胞核内，使之得到复制和表达。目前使用的基因载体可分为病毒性载体和非病毒性载体。病毒载体有逆转录病毒(retrovirus, RV)、腺病毒(adenovirus, AV)、腺相关病毒(adeno-associated virus, AV)、痕疼病毒(herpes simplexvirus, HSV)、慢病毒(Ientivirus)等。病毒载体转染效率高，但改造病毒易引发机体强烈的免疫反应，具有潜在致癌性且其价格昂贵。这些缺陷使得病毒性载体的应用受到很大限制。常见的非病毒性载体包括裸DNA(naked DNA)、脂质体和脂质体复合物(liposanes orlipoplexes)以及阳离子高聚物(cat1nic polymer)。裸露DNA转染主要采用物理方法，例如针注射、基因枪、电穿孔等，将目的基因直接导入细胞中进行表达。脂质体由磷脂双层构成，为两亲性结构分子，通过自组装可构成水相内核的脂质微囊，将DNA包裹，可用作制备靶向性、无免疫原性、缓释时间长、毒副作用低及载药率高的抗癌药物载体。阳离子高聚物不仅具有低毒、低免疫原性、低致癌性，易于制备和携带目的基因、强静电作用、有效络合DNA等特点，且其便于进行靶向性和生物适用性改性，是近年来研宄最广泛的基因载体材料。化学疗法是将药物经血管带到全身，因为所用药物都是有害，甚至是带毒性的，体内细胞，无论是否为癌细胞，都受到破坏。这极大地影响了化疗的治疗效果，对患者的身心造成了很大的伤害。提高化疗效果的关键是如何提高药物的靶向性和降低药物的毒副作用。通过载体包裹抗肿瘤药物，能够减少体内酶对抗肿瘤药物的破坏与降解从而提高了药物在体内的稳定性。同时包裹在载体内的抗肿瘤药物通过缓释过程能够在较长时间内保持有效的血液浓度，延长药物的作用时间，提高抗肿瘤药物的利用率，降低药物使用的频率。更为重要的是可以通过在抗肿瘤药物载体上修饰各类靶向分子实现药物的靶向运输，降低药物的毒副作用。纳米科技的发展及纳米药物输送体系的建立使得医药领域很多传统难题得以解决，纳米诊疗体系相比于传统药物，其靶向性、生物利用度等都有很大提高，同时此类新型体系可以改善药物稳定性及药物释放动力学行为，从而更大程度地提高治疗效果并减小副作用。因此，开发新型、多样化的纳米药物输送体系是贯穿纳米生物医学的重要课题。目前，常见的药物载体有脂质体、高分子聚合物、金纳米颗粒介孔二氧化硅、量子点等。近年来，无机纳米粒子因其具有光、电、磁等独特性质、尺寸形貌可控性好、比表面积大等一系列优点，引起了人们的广泛关注。介孔二氧化硅纳米颗粒的研宄始于20世纪90年代，研宄者们先后合成了具有六方、立方孔道，孔径为2-10nm的MCM-41、MCM-48型介孔二氧化硅材料。介孔二氧化硅由于具有有序且连续可调的介孔结构、大的比表面积、优良的生物相容性及表面功能基团易于被修饰等特性，更是成为药物输送体系研宄的热点，尤其，介孔氧化硅材料骨架结构稳定、孔径规则且在2-50nm范围内连续可调、表面富含羟基易于修饰等优点，可以有效装载和输送不同大小和种类的药物。通过改变介孔二氧化硅的结构参数，如孔径、比表面积和比孔容等，可以实现对药物释放的改善。特定形貌的介孔材料的制备在工业上的应用是非常重要的，例如氧化硅膜材料在催化，分离，光学器件上的应用以及单分散球结构在色谱分离等方面的应用等等。因此介孔氧化硅材料的形貌控制生长也成为一项重要的基础研宄工作。由于介孔氧化硅生长过程中，中间态液晶相自组装行为变化丰富，导致介孔氧化硅的形貌也丰富多变。由于其同时又兼有可控的规则的孔道结构，因此能否同时实现介孔材料在微观和宏观两个层次的可控制备。介孔氧化硅的形貌很大程度上是由其中间态液晶相结构所决定的，因此能够对这一自组装结构有影响的因素也都同时是影响产物形貌的重要因素。例如，两亲分子可能的自组装结构，硅源及其水解缩聚，硅酸盐与两亲分子头基不同的作用方式，表面活性剂的浓度，有机分子以及无机盐添加剂，温度，搅拌速度以及PH值影响等等都是介孔化合物形貌的重要因素，实验过程中对这些条件进行改变可以实现对不同形貌的介孔氧化硅的形貌控制。到目前，人们已相继合成了多种形貌的介孔氧化硅，如球状，囊泡状，陀螺，多面体，纳米棒，纳米线，纳米纤维，须状，螺旋，纳米带，纳米管，薄膜，薄片，单块等。目前，纳米技术发展虽然可以合成许多形貌的介孔氧化硅纳米颗粒，但是氧化硅纳米颗粒的均一性、分散性仍I日是合成一大难题。近年来，随着活性/可控自由聚合(living/controlled radicalpolymerizat1n, LRP)研宄的快速发展，LRP技术在制备具有新颖特定功能的生物高分子材料中也得到了巨大发展。LRP集活性可控聚合与自由基聚合的优点为一身，不但可得到相对分子量分布极窄、相对分子量可控、结构明晰的高分子，而且可聚合的单体多，反应条件温和易控制。所以，LRP技术具有极高的实用价值，受到了高分子化学家们的重视。其中，ATRP(原子转移自由基聚合)近几年得到了迅速发展并有着重要应用价值。其所用引发剂一般为卤代烷烃，基本原理是通过一交替的“活化-去活”可逆反应使体系中游离基浓度极低，迫使不可逆终止反应降低到最低程度，而链增长反应仍可进行，从而实现“活性”聚合。ATRP反应温度适中，适用单体范围广，甚至可以在少量氧存在下进行，对高分子材料的分子设计不需复杂的合成路线，是现有其它活性聚合方法无法比拟的，因此可以说ATRP技术的出现开辟了活性聚合的新领域。随着高分子科学、医学、生物学以及工程学等多门学科的相互交融、相互渗透和迅速发展，高分子基因载体材料进入一个快速发展的时期。目前，文献中报道一系列非病毒阳离子聚合物载体，包括聚-L-赖氨酸(poly (L-1ysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物(poly (amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙稀酸N，N-二甲酸基乙醋(poly (2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)、聚乙稀亚胺(polyethylenimine,PEI)等。其中PEI具有较高的转染效率，是阳离子非病毒载体中公认的“金本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于氧化硅纳米颗粒构建多功能基因治疗载体及药物载体的方法，其特征在于，其具体操作步骤为：1)硅烷偶联剂法制备氨基功能化氧化硅纳米颗粒：先将乙醇与水混合均匀，然后加入3‑氨丙基三乙氧基硅烷充分混合，再加入氧化硅纳米颗粒分散均匀后0‑80℃反应1‑10h，最后加入三乙胺0‑80℃继续反应12‑48h；将所得产物用甲醇、乙醇、或水离心洗涤，真空干燥，100‑150℃高温固化1‑6h；其中氧化硅纳米颗粒与3‑氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为0.1‑50，优选0.5‑10；氧化硅纳米颗粒与三乙胺的质量比为0.01‑20，优选0.1‑4.5；氧化硅纳米颗粒与水的质量比为0.01‑50，优选0.01‑10；氧化硅纳米颗粒与乙醇的质量比为0.01‑50，优选0.01‑4.5；2)制备氧化硅纳米颗粒引发剂：先将步骤1)制备的氨基功能化氧化硅纳米颗粒溶于有机溶剂，然后加入2‑溴异丁酰溴、三乙胺，室温反应1‑12h；产物用体积比为0.1‑2的甲醇与水混合溶剂离心洗涤，真空干燥；其中氨基功能化氧化硅纳米颗粒与2‑溴异丁酰溴的质量比为0.01‑10，优选0.5‑9.5；氨基功能化氧化硅纳米颗粒与有机溶剂质量比为50‑500；氨基功能化氧化硅纳米颗粒与三乙胺质量比0.01‑20。3)ATRP聚合反应：在无氧环境下先将步骤2)制备的氧化硅纳米颗粒引发剂溶于水，然后加入有机溶剂、单体，再加入配体，最后加入CuBr2、CuBr引发活性可控自由基聚合；反应温度为0‑60℃，优选5‑55℃，更优选10‑50℃；反应时间为l‑200min，优选l‑190min；其中水与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为50‑500，优选50‑490；单体与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为50‑500，优选50‑490；配体与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为1‑50，优选1‑15；CuBr与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为0.1‑10，优选0.1‑9.5；CuBr2与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为0.1‑5，优选0.1‑4.5；有机溶剂与氧化硅纳米颗粒引发剂的质量比为50‑500，优选50‑490；4)步骤3)的聚合反应完成后加入水或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，水的加入量为氧化硅纳米颗粒引发剂质量的100‑500倍；然后放入截留分子量为2500‑4500MW的透析袋中，在去离子水中透析；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得基于氧化硅纳米颗粒构建的多功能基因治疗载体及药物载体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐福建，赵娜娜，林心怡，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11