一种改良的毕赤酵母蛋白表达载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种改良的毕赤酵母蛋白表达载体及其构建方法。本发明专利技术根据载体pPinkα‑HC序列，选择其中一段约300bp的序列设计一对引物pPinkα‑HCM‑Fse1‑F和pPinkα‑HCM‑BamH1‑R，在其两头的粘性末端酶Fse1和BamH1中插入了新的唯一的酶切位点Sal1、Pst1、PspOM、Nco1、Apa1、EcoR1，并在后面接上6个His标签CATCATCATCATCATCAT，实现了粘性末端的酶切位点数量多、内切酶的通用性好、价格低廉、酶切位点之间的间隔充裕、适合为双酶切提供保护碱基，同时还插入了6个His标签，以方便对获取的目标蛋白做Western blot验证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体来说涉及一种改良的毕赤酵母蛋白表达载体及其构建方法。
技术介绍
pPinkα-HC是毕赤酵母蛋白表达体系中常用的载体，但其多克隆位点只有Stu1、Kpn1、Fse1、Nae1和Swa1，不仅可选择的数量较少，而且含有特异性连接效率较低的平末端酶切位点。这些限制性内切酶不太常见，很多实验室需另行购买，且单位酶活所对应的价格也较昂贵。此外，这些酶切位点间隔太近，缺乏有效的保护碱基保证双酶切的效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有毕赤酵母蛋白表达载体pPinkα-HC中多克隆位点数量少、平末端位点多、所用到的酶通用性差、价格高、且酶切位点间隔紧密等不足，提供一种多克隆位点多、平末端位点少、所用到的酶通用性高，连接效率高的改良的毕赤酵母蛋白表达载体及其构建方法。本专利技术的改良的毕赤酵母蛋白表达载体，其是通过以下方法构建的，包括以下步骤：以载体pPinkα-HC为模板，以上游引物pPinkα-HCM-Fse1-F和下游引物pPinkα-HCM-BamH1-R作为引物进行PCR扩增，扩增产物用Fse1和BamH1双酶切，得到双酶切后的产物，命名为插入子；将载体pPinkα-HC用Fse1和BamH1双酶切，得到双酶切后的产物，命名为酶切载体，将插入子和酶切载体连接获得改良的毕赤酵母蛋白表达载体；所述的上游引物pPinkα-HCM-Fse1-F的核苷酸序列为：5’-GTAGGCCGGCCCTGCAGTCGACGGGCCCATGGAATTCATCATCATCATCATCATTGATTTAAATACAGGCCCC-3’；(如SEQIDNO.1所示)。所述的下游引物pPinkα-HCM-BamH1-R的核苷酸序列为:5’-CCGCGGATCCAGCTTGCA-3’(如SEQIDNO.2所示)。。本专利技术根据载体pPinkα-HC序列，选择其中一段约300bp的序列设计一对引物pPinkα-HCM-Fse1-F和pPinkα-HCM-BamH1-R，在其两头的粘性末端酶Fse1和BamH1中插入了新的唯一的酶切位点Sal1、Pst1、PspOM、Nco1、Apa1、EcoR1，并在后面接上6个His标签CATCATCATCATCATCAT，实现了粘性末端的酶切位点数量多、内切酶的通用性好、价格低廉、酶切位点之间的间隔充裕、适合为双酶切提供保护碱基，同时还插入了6个His标签，以方便对获取的目标蛋白做Westernblot验证。附图说明：图1是单酶切检验图，其中1为pPinkα-HC(Fse1酶切)，2为新载体pPinkα-HCM(EcoR1酶切)；图2是新载体pPinkα-HCM测序结果(反向互补序列)；图3是原pPinkα-HC的多克隆位点示意图；图4是新载体pPinkα-HCM的多克隆位点示意图，在1214bp之后的Fse1和Swa1之间为新增加的酶切位点(黄色背景)，绿色背景为6His标签；图5是pPinkα-HCM::CsGlu13570转化的毕赤酵母；图6是用新载体pPinkα-HCM中的6His标签在Westernblot中检验酵母中表达的CsGlu13570蛋白。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：a)插入片段的PCR：以载体pPinkα-HC(购自Invitrogen(LifeTechnologies)公司)为模板、以上游引物pPinkα-HCM-Fse1-F和下游引物pPinkα-HCM-BamH1-R为引物。PCR扩增用Takara的PrimeSTARMaxPremix(2×)20μl，上游引物pPinkα-HCM-Fse1-F和下游引物pPinkα-HCM-BamH1-R各10μM，载体pPinkα-HC模板0.1μl，加双蒸水补足40μl。PCR扩增程序为98℃30sec，1个循环；98℃15sec，45℃15sec，72℃10sec，1个循环；98℃15sec，72℃10sec，32个循环；72℃10sec，1个循环，得到插入片段的PCR产物。上游引物pPinkα-HCM-Fse1-F：5’-GTAGGCCGGCCCTGCAGTCGACGGGCCCATGGAATTCATCATCATCATCATCATTGATTTAAATACAGGCCCC-3’；下游引物pPinkα-HCM-BamH1-R:5’-CCGCGGATCCAGCTTGCA-3’。b)插入片段的双酶切：将插入片段的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收目标条带后，用NEB的限制性内切酶做酶切。反应体系40μl，其中Cutsmartbuffer4μl，PCR产物15μl，Fse1和BamH1各0.3μl，酶切两小时后过滤回收，得到双酶切后的插入子。c)载体的双酶切：将载体pPinkα-HC做双酶切，反应体系40μl，其中Cutsmartbuffer4μl，pPinkα-HC质粒15μl，Fse1和BamH1各0.3μl，酶切两小时后割胶回收，得到双酶切后的载体。d)连接转化：将双酶切后的插入子和双酶切后的载体用Promega的T4连接酶连接，10μl体系中含插入子4μl，载体1μl。连接后转化到DH5a大肠杆菌后冰浴半小时，42℃热激后加LB培养基在37℃摇床中230rpm培养1h，取200μl涂氨苄抗性的培养板，12小时后挑阳性单克隆送测鉴定，由此得到新载体pPinkα-HCM(其是由双酶切后的插入子和双酶切后的载体连接而成)。e)结果验证：新载体pPinkα-HCM进行酶切的结果正常(图1)，测序验证结果正确(图2)。载体pPinkα-HC(图3)与新载体pPinkα-HCM(图4)的多克隆位点区域的比较显示了新引入的多克隆位点间及新多克隆位点在新载体pPinkα-HC上的相互位置关系。f)应用实例从转录组数据库中筛选茶叶的糖苷酶基因CsGlu13570(NCBI登录号：GBBZ01013516.1)，在酵母中表达时，旧载体pPinkα-HC上有限的多克隆位点所需的内切酶比较生僻且价格昂贵，且有几个是平末端酶，连接效率低。而新载体pPinkα-HCM中引入的Sal1和EcoR1是常用的酶切位点。以茶叶基因组DNA作为模板，通过PCR扩增得到糖苷酶基因CsGlu13570，其前后两端分别具有酶切位点Sal1和EcoR1，PCR产物经Sal1和EcoR1双酶切后与同样经过Sal1和EcoR1双酶切的新载体pPinkα-HCM连接，连接产物(pPinkα-HCM::CsGlu13570)转化进入酵母，实验结果显示转化后的酵母长势良好(图5，2个圆圈中所示)，CsGlu13570蛋白经诱导表达纯化后，经Westernblot检测发现，通过新载体pPinkα-HCM中插入的6His标签在Westernblot中检验到了重组蛋白的成功表达(图6)。序列表<110>中国科学院华南植物园<120>一种改良的毕赤酵母蛋白表达载体及其构建方法<160>2<210>1<211>73<212>DNA<213>人工序列<400>1GTAGGCCGGCCCTGCAGTCGACGGGCCCAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良的毕赤酵母蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以载体pPinkα‑HC为模板，以上游引物pPinkα‑HCM‑Fse1‑F和下游引物pPinkα‑HCM‑BamH1‑R作为引物进行PCR扩增，扩增产物用Fse1和BamH1双酶切，得到双酶切后的产物，命名为插入子；将载体pPinkα‑HC用Fse1和BamH1双酶切，得到双酶切后的产物，命名为酶切载体，将插入子和酶切载体连接获得改良的毕赤酵母蛋白表达载体；所述的上游引物pPinkα‑HCM‑Fse1‑F的核苷酸序列为：5’‑GTAGGCCGGCCCTGCAGTCGACGGGCCCATGGAATTCATCATCATCATCATCATTGATTTAAATACAGGCCCC‑3’；所述的下游引物pPinkα‑HCM‑BamH1‑R的核苷酸序列为:5’‑CCGCGGATCCAGCTTGCA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种改良的毕赤酵母蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以载体pPinkα-HC为模板，以上游引物pPinkα-HCM-Fse1-F和下游引物pPinkα-HCM-BamH1-R作为引物进行PCR扩增，扩增产物用Fse1和BamH1双酶切，得到双酶切后的产物，命名为插入子；将载体pPinkα-HC用Fse1和BamH1双酶切，得到双酶切后的产物，命名为酶切载体，将插入子和酶切载体连接获得改良的毕赤酵母蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅鑫，杨子银，周瀛，傅秀敏，东方，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44