植物中间表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供的植物中间表达载体为pEXP‑DR，具有序列表中<400>1所示的序列，通过PCR扩增和酶切技术在质粒PSK中连接启动子、终止子获得，在植物基因工程载体构建方面具有重要应用价值。

Plant intermediate expression vector and construction method and application thereof

The invention provides a plant expression vector for pEXP intermediate DR, has a sequence of < 400> sequence is shown in Figure 1, in connection with plasmid PSK promoter and terminator was obtained by PCR amplification and enzyme digestion, the carrier of plant genetic engineering construction has important application value.

【技术实现步骤摘要】
植物中间表达载体及其构建方法与应用
本专利技术涉及生物
，尤其是植物中间表达载体及其构建方法与应用。
技术介绍
目前，在构建植物表达载体时，为了构建完整的表达盒和选择合适的酶切位点，需要将目的片段在多个中间表达载体之间进行多步构建。而把表达盒和多克隆位点构建在一个载体上，作为通用载体适应于多条目的片段，并自带表达盒，大大节省了工作人员构建载体的时间，降低了复杂的多步构建中产生的费用，同时也减少了构建过程中出现错误的几率，是现阶段技术人员致力研究的
技术实现思路
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技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供植物中间表达载体。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供所述植物中间表达载体的构建方法。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供所述植物中间表达载体的应用。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：植物中间表达载体，pEXP-DR，具有序列表中<400>1所示的序列。上述植物中间表达载体的构建方法，通过PCR扩增和酶切技术在质粒PSK中连接了外源片段DR、启动子、终止子序列，所述外源片段DR序列为序列表中<400>13所示的序列，启动子序列为序列表中<400>2所示的序列，所述终止子序列为序列表中<400>3所示的序列。上述植物中间表达载体在植物基因工程载体构建方面的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术所述植物中间表达载体pEXP-DR把表达盒和多克隆位点构建在一个载体上，作为通用载体适应于多条目的片段，并自带表达盒，使植物中间表达载体不仅具有完整的表达盒，而且在各序列的上下游，添加了多克隆位点，便于外源基因片段的导入和该表达盒与各种植物表达载体的连接，大大节省了工作人员构建载体的时间，降低了复杂的多步构建中产生的费用，同时也减少了构建过程中出现错误的几率，使植物基因工程载体构建更加便利和高效。附图说明图1为载体PEXP构建流程图；图2为pT-PA的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M：DNA分子量标准Trans2Kplus；泳道1：pT-PA的PCR鉴定；泳道2：pT-PA的酶切鉴定；PA所标示的箭头指向酶切后0.3kb的PA片段；图3为pT-TP的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M：DNA分子量标准DGL2000；泳道1：pT-TP的PCR鉴定；泳道2：pT-TP的酶切鉴定；TP所标示的箭头指向酶切后0.2kb的TP片段；图4为pT-35S的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M：DNA分子量标准DGL2000；泳道1：pT-35S的PCR鉴定；泳道2：pT-35S的酶切鉴定；35S所标示的箭头指向酶切后0.8kb的35S片段；图5为pSK-PA的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M1、M2：DNA分子量标准DGL2000、Trans2Kplus；泳道1：pSK-PA的PCR鉴定；泳道2：pSK-PA的酶切鉴定；PA所标示的箭头指向酶切后0.3kb的PA片段；图6为pSK-TP-PA的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M：DNA分子量标准DGL2000；泳道1：pSK-TP-PA的PCR鉴定；泳道2：pSK-TP-PA的酶切鉴定；TP-PA所标示的箭头指向酶切后0.5kb的TP-PA片段；图7为pEXP的PCR和酶切鉴定，其中，泳道M：DNA分子量标准DGL2000；泳道1：pEXP的PCR鉴定；泳道2：pEXP的酶切鉴定；35S-TP-PA所标示的箭头指向酶切后1.3kb的整个表达盒35S-TP-PA片段；图8为中间载体PEXP-DR构建流程图；图9为测序对比图；图10为pEXP-DR的质粒及酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M:DNA分子量标准Trans15K；泳道1：pEXP-DR的质粒；泳道2：用NdeI和BglП双酶切pEXP-DR的质粒。图11为载体1301-PEXP-SmGPPS的构建流程。图12为克隆SmGPPS基因的琼脂糖有凝胶电泳图，其中泳道M:DNA分子量标准Trans2KPlusП；泳道1：负对照；泳道2：克隆得到的SmGPPS基因。图13为pEXP-DR-SmGPPS的质粒及酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M:DNA分子量标准DL15000；泳道1：pEXP-DR-SmGPPS的质粒；泳道2：用KpnI和XbaI双酶切pEXP-DR-SmGPPS的质粒。图14为载体1301-PEXP-SmIS1的构建流程。图15为克隆SmIS1基因的琼脂糖有凝胶电泳图，其中泳道M:DNA分子量标准Trans2K；泳道1：负对照；泳道2：克隆得到的SmIS1基因。图16为pEXP-DR-SmIS1的质粒及酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M:DNA分子量标准DL15000；泳道1：pEXP-DR-SmIS1的质粒；泳道2：用KpnI和XbaI双酶切pEXP-DR-SmIS1的质粒。具体实施方式实施例1构建载体PEXP，具体流程见图1。根据所述构建流程如下：首先要获得含有所需各个组件的T载体。以质粒pCAMBIA1301为模板，PA1、PA2为引物，通过PCR扩增片段PA(PolyA，终止子)后将其与T载体连接，获得pT-PA，PCR和酶切鉴定(见图2)证明pT-PA构建正确，送至公司测序证明其序列也没有错误且酶切位点与设计相符。以实验室保存的、含有豌豆Rubisco小亚基上叶绿体定位信号肽编码序列的质粒为模板，TP5、TP6为引物，通过PCR扩增片段TP后将其与T载体连接，获得了pT-TP，pT-TP的PCR和酶切鉴定正确(见图3)。送至公司测序证明其序列没有错误且酶切位点与设计相符。以质粒pCAMBIA1301为模板，35S1、35S2为引物，通过PCR扩增片段35S后将其与T载体连接，获得pT-35S，转化子的PCR和酶切鉴定见图4。送至公司测序证明其序列没有错误且酶切位点与设计相符。同时用限制性内切酶KpnI和SacI双酶切质粒pSK和pT-PA，将pSK双酶切后的大片段(约2.9kb)与pT-PA双酶切后的小片段(约0.3kb)进行回收、纯化、连接后转化大肠杆菌，获得转化子pSK-PA，通过PCR和酶切反应鉴定其正确性(见图5)。然后同时用限制性内切酶KpnI和ApaI双酶切pSK-PA和pT-TP，将pSK-PA双酶切后的大片段(约3.2kb)和pT-TP双酶切后的小片段(约0.2kb)进行回收、纯化、连接后转化大肠杆菌，获得转化子pSK-TP-PA，然后通过PCR和酶切反应证明其构建的正确性(见图6)。最后同时用限制性内切酶KpnI和BglII双酶切pSK-TP-PA和pT-35S，将pSK-TP-PA双酶切后的大片段(约3.4kb)与pT-35S双酶切后的小片段(约0.8kb)进行回收、纯化、连接后转化大肠杆菌，获得转化子pEXP，然后通过PCR(扩增0.8kb的35S组件)和酶切反应(切下1.3kb的整个表达盒35S-TP-PA)。证明其构建无误(见图7)，最后还通过测序证明三个组件连接处也都符合设计。实施例2根据PEXP载体进行改造后，构建中间载体PEXP-DR，具体流程见图8。根据所述构建流程：(1)从SmIS1基因中用引物DR1和DR2克隆一段688bp的片段，该片段中没有本专利技术所要利用的酶切位点，在片段的上游嫁接酶切位点BglII，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物中间表达载体，其特征在于：为pEXP‑DR，具有序列表中<400>1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种植物中间表达载体，其特征在于：为pEXP-DR，具有序列表中<400>1所示的序列。2.权利要求1所述植物中间表达载体的构建方法，其特征在于：通过PCR扩增和酶切技术在质粒PSK中连接了外源片段DR、启动子、终止子序列，所述外...

【专利技术属性】
技术研发人员：向蓓蓓，王勇，李晓雪，白雪亮，马琳，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：天津,12