The invention discloses a isocaudarner combined with Gateway cloning method of multi gene expression vector was constructed, which comprises the following steps: (1) construction of M35S-8GWN vector and MNOS-8GWN vector and MOCS-8GWN vector; (2) cloning the target gene by Not I and Sbf I each gene were assembled into M35S-8GWN vector, MNOS-8GWN vector and MOCS-8GWN vector, the formation of multiple gene expression cassette; (3) the expression cassette of multiple genes by isocaudarner AsiS I and Pac I together; (4) the expression of multiple genes by Gateway LR reaction box connected to the target expression vector. Three kinds of vector M35S-8GWN, MNOS-8GWN and MOCS-8GWN, which are used to construct multi gene plant expression vectors, are also disclosed.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种多基因表达载体的构建方法，尤其涉及一种同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法。
技术介绍
转基因技术广泛应用于动物、植物和微生物的基因功能研究、遗传改良和药物生产等，在科学领域发挥着越来越重要的作用。转基因技术不仅可以将生物体自身基因导入生物体基因组中，实现自身基因的超表达；还可以将其他物种的基因或者人工合成的基因导入生物体基因组中，实现外源基因的表达、自身基因的干扰和敲除等。目前转基因技术多用于在对单个基因进行遗传转化，然而生物体的生长发育、形态建成、新陈代谢、衰老凋亡等是个极其复杂的过程，每个生物学过程都受到多个基因在空间和时间上的调控，而且很多蛋白只有形成特定的复合物才能发挥功能。因此，通过单个基因的表达常常不能很好地揭示出基因功能和信号通路。随着技术的发展，通过多基因共表达来研究基因功能和信号通路已经成为生命科学的重要手段。目前主要有四种方法实现多基因共表达体系的构建：杂交法、共转化法(多个表达载体共同转化)、连续转化法(多个表达载体多次转化)和一次转化法(构建多基因表达载体一次转化)。与前三种方法相比，一次转化法操作简单、成功率高，受到研究者们的亲睐。进行一次转化法需要构建多基因表达载体，多基因表达载体主要有两类：一是多顺反子表达载体，即把多个基因串联起来，由一个启动子驱动的表达载体；二是含多个表达盒的载体，即每个基因由独立的
【技术保护点】
一种同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建M35S‑8GWN载体、MNOS‑8GWN载体和MOCS‑8GWN载体，所述三种载体的结构分别如图2～4所示，构建方法为用EcoR I分别酶切含有M35S序列、MNOS序列和MOCS序列的pUC57载体,分别与用EcoR I酶切并去磷酸化的pCR8/GW/TOPO载体连接，获得M35S‑8GWN载体、MNOS‑8GWN载体和MOCS‑8GWN载体；所述M35S序列从5’端到3’端依次含有EcoR I酶切位点、AsiS I酶切位点、35S启动子、Not I酶切位点、Sbf I酶切位点、HA标签序列、35S终止子、Pac I酶切位点、Asc I酶切位点、EcoR I酶切位点，所述M35S序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；所述MNOS序列从5’端到3’端依次含有EcoR I酶切位点、AsiS I酶切位点、NOS启动子、Not I酶切位点、Sbf I酶切位点、Flag标签序列、NOS终止子、Pac I酶切位点、Asc I酶切位点、EcoR I酶切位点，所述MNOS序列的核苷酸序列...
【技术特征摘要】
1.一种同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法，其特征
在于，包括以下步骤：
(1)构建M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN载体，所述三种载体
的结构分别如图2～4所示，构建方法为用EcoRI分别酶切含有M35S序列、MNOS
序列和MOCS序列的pUC57载体,分别与用EcoRI酶切并去磷酸化的
pCR8/GW/TOPO载体连接，获得M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN
载体；所述M35S序列从5’端到3’端依次含有EcoRI酶切位点、AsiSI酶切
位点、35S启动子、NotI酶切位点、SbfI酶切位点、HA标签序列、35S终止
子、PacI酶切位点、AscI酶切位点、EcoRI酶切位点，所述M35S序列的核
苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；所述MNOS序列从5’端到3’端依次含
有EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、NOS启动子、NotI酶切位点、SbfI
酶切位点、Flag标签序列、NOS终止子、PacI酶切位点、AscI酶切位点、EcoR
I酶切位点，所述MNOS序列的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示；所述MOCS
序列从5’端到3’端依次含有EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、OCS增强
子、OCS启动子、NotI酶切位点、SbfI酶切位点、Myc标签序列、OCS终止子、
PacI酶切位点、AscI酶切位点、EcoRI酶切位点，所述MOCS序列的核苷酸
序列如序列表SEQIDNO.3所示；
(2)克隆各目的基因，然后通过NotI和SbfI将各目的基因分别组装到
M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN载体中，形成多个具有不同启动
子、标签和终止子的独立表达盒；
(3)将步骤(2)得到的多个独立表达盒通过同尾酶AsiSI和PacI串联在一
起，得到串联的多个基因表达盒；
(4)将步骤(3)得到的串联表达盒通过GatewayLR反应连接到目标表达载体
上，即得到具有多个基因表达盒的表达载体。
2.如权利要求1所述的同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体
的方法，其特征在于，步骤(2)中所述目的基因为：拟南芥AtATG1a基因、AtATG1b
基因和AtATG1c基因。
3.如权利要求1所述的同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体
的方法，其特征在于，步骤(2)中所述目的基因为拟南芥AtSnRK1.1基因、
AtSnRK1.2基因和AtATG13a基因。
4.如权利要求2或3所述的同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达
载体的方法，其特征在于，步骤(2)中所述将目的基因分别组装到M35S-8GWN
载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN载体中的方法为：先扩增3个目的基因，扩
增后回收目的片段，TA克隆到pEASY-T1Simple载体上，得到3个重组载体，
分别用NotI和SbfI双酶切该3个重组载体，回收各基因片段；用NotI和
SbfI双酶切步骤(1)中构建的M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN
载体，用胶回收试剂盒回收酶切后的载体片段；用T4DNA连接酶将3个回收的
目的基因片段分别与三个回...
【专利技术属性】
技术研发人员：任茂智，王凯，冯丽，董攀，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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