肠道病毒71型感染性克隆及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种肠道病毒71型感染性克隆及其构建方法和应用。肠道病毒71型感染性克隆是以从肠道病毒71型毒株SZ2010-EV71提取的RNA为模板，经RT-PCR扩增得到全基因组序列，再与载体连接，酶切筛选阳性克隆而获得的。本发明专利技术仅用了一对引物，就扩增构建成功了感染性克隆，大大简化了EV71的反向遗传学操作步骤；获得的感染性克隆及其序列信息，为EV71的致病机理研究提供了一个有效的平台，可进行多个重要毒株或新毒株的全基因组序列获得及病毒特性分析，同时为EV71的抗病毒药物筛选平台的建立及疫苗的评估提供了重要基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，更具体地，本专利技术涉及肠道病毒71型感染性克隆及其构建方法和应用。
技术介绍
肠道病毒71型(EV71)病毒和柯萨奇病毒A16 (Coxsckie A16, CA16)是手足口病的主要病原，已在世界范围内引起多次暴发与流行，主要发病者为婴幼儿，严重危害儿童健康，CA16引起的症状轻微，而EV71的感染易引起无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病，易发生死亡。肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。根据我国卫生部的最近数据，2010和2011两个年度报道手足口病病例分别为1774669和1619706例，其中包括死亡病例905和509例。EV71抗体在成人血清中的阳性率达到65%以上，说明了这种病毒的广泛传播，每年春夏季温度升高时都会进入感染高峰期，流行趋势从散发逐渐趋于有小型聚集性爆发。然而，手足口病的相关科研工作比较薄弱，发达国家拥有较好的科研平台，亚太地区为主要流行区域，却对EV71的关注很少，至今在临床上还没有有效的疫苗和药物，对EV71进行有效的预防和控制。利用反向遗传学方法研究RNA病毒，在质粒水平上来操作、研究RNA病毒，获得的病毒型表型稳定，操作方便，为EV71的深入研究提供了一个很好的基础平台。但由于EV71的全长基因组有约7.5 Kb的长度，因此，已报道的文章中多是通过分为多段PCR来测序或进一步构建感染性克隆，操作起来繁复较多，严重限制了对EV71的深入研究
技术实现思路
基于此，本专利技术提供了一种肠道病毒71型感染性克隆及其简化的构建方法，以及构建得到的肠道病毒71型感染性克隆的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案:一种肠道病毒71型感染性克隆的构建方法，包括以下步骤:(I)、以从肠道病毒71型毒株SZ2010-EV71提取的RNA为模板，SEQ ID NO: 2为引物，反转录得到cDNA ;所述SZ2010-EV71的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示；(2)、以步骤(I)得到的cDNA为模板，SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2为引物，PCR扩增得到肠道病毒71型的全基因组序列；(3)、将步骤(2)得到的肠道病毒71型的全基因组序列与载体连接，酶切，筛选得到阳性克隆，即为肠道病毒71型的感染性克隆。在其中一个实施例中，步骤(I)中所述反转录的程序为:42°C—个小时，70°C 15分钟。在其中一个实施例中，步骤⑵中所述PCR的程序为:94°C 30秒，55°C 30秒，72 °C 8分钟，30个循环。在其中一个实施例中，步骤(3)中所述载体为T0P0-XL-PCR载体。本专利技术还提供了上述构建方法构建得到的肠道病毒71型感染性克隆。本专利技术还提供了肠道病毒71型毒株SZ2010-EV71，其具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了包含上述肠道病毒71型感染性克隆的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠埃希氏菌(Escherichia coli) T0P0-SZ2010-EV71/DH5 α。本专利技术还提供了上述肠道病毒71型感染性克隆在制备抗肠道病毒71型药物或疫苗中的应用。本专利技术从深圳市2010年手足口病的一例死亡病例的病毒分离株出发，仅用了一对引物，就扩增构建成功了感染性克隆，大大简化了 EV71的反向遗传学操作步骤，为EV71重要毒株的序列获得和分析、致病机理研究、药物筛选提供方法提供了更简便的平台；在构建成功感染性克隆后，设计了八条引物对一个毒株的多个克隆进行了测序和序列比对，最终获得该毒株的全基因组序列。从而从序列到方法上都填补了国内手足口病研究的空白。为EV71的致病机理研究提供了一个有效的平台，可进行多个重要毒株或新毒株的全基因组序列获得及病毒特性分析，同时为EV71的抗病毒药物筛选平台的建立及疫苗的评估提供了重要基础。本专利技术的构建肠道病毒71型感染性克隆的方法，利用一对通用引物可扩增目前临床样本的绝大多数EV71病毒。附图说明 图1为来自genebank的现有EV71a、b、c三个亚型的代表毒株的基因组序列的比对图；图2为本专利技术实施例1中RT-PCR后，采用琼脂糖凝胶电泳对PCR结果进行检测的图谱；图3为将图2中得到的PCR产物连接到T0P0-XL-PCR载体中得到的感染性克隆；图4为通过对20株代表毒株和本专利技术获得的毒株分离株SZ2010-EV71VP1序列比对，绘制的系统进化树；图5为实施例1中构建得到的感染性克隆经恢复转染细胞后的病变图；其中A为阴性对照，B为恢复出的病毒；图6为采用EV71VP1的抗体对图5中的病变细胞进行标记后，病变细胞中病毒VPl蛋白的分布图；其中C为阴性对照，D为恢复出的病毒。具体实施方案在以下实施例中，所用的EV71毒株分离株是分离自2010年深圳临床检测样本中的一例死亡病例的粪便(深圳市儿童医院防保科，样本的采集方法、储存、运送、处理均按照卫生部《手足口病预防控制指南(2008年版)》(6)执行)，经分析检测后得到的阳性标本，命名为SZ2010-EV71，毒株保藏于深圳市疾病预防控制中心，本领域技术人员可以购买得到。该毒株分离株在序列上有潜在的致病序列或致病突变，病毒致细胞病变效率强，存在进一步的研究价值。以下实施例仅用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的包含范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1E71感染性克隆的构建包括以下步骤:1、扩增引物的设计与合成从genebank中选取EV71a, b, c三个亚型的代表毒株的基因组序列进行比对,如图1所示，在病毒基因组3’和5’端都有30多个碱基的保守序列，因此，理论上来说，选取此段序列设计引物，可扩增EV71的绝大多数毒株的全基因组序列。本专利技术的专利技术人设计了一对可兼并大部分 EV71 的保守引物 EV71genomeS(SEQ ID NO:1)和 EV7IgenomeA(SEQ IDNO:2)，由Takara公司合成。其中:正向引物(上游引物)EV71genomeS5’端加入SnaBI酶切位点和T7启动子序列，反向引物(下游引物)EV71gen0meA5’端加入30个T和MluI酶切位点，具体引物序列如下:EV71genomeS: 5，-GCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCC-3’ (SEQ ID NO:1)EV71 genomeA: 5，-ACGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTATTCTGGTTATAACAAATTTAC-3’ (SEQ ID NO:2)2、RT-PCR按照病毒RNA提取试剂盒(罗氏生物有限公司)提取死亡病例粪便样本的RNA，反转录的引物为反向引物 EV 71genomeA(SEQ ID NO: 2)，按 Primescript RT-PCR Kit (TAKARA公司)说明书构建20 μ L反应体系，反转录程序为:42°C—个小时，70°C 15分钟；PCR扩增的引物为正向引物EV71 genom本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肠道病毒71型感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、以从肠道病毒71型毒株SZ2010?EV71提取的RNA为模板，SEQ?ID?NO:2为引物，反转录得到cDNA；所述SZ2010?EV71的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:9所示；(2)、以步骤(1)得到的cDNA为模板，SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2为引物，PCR扩增得到肠道病毒71型的全基因组序列；(3)、将步骤(2)得到的肠道病毒71型的全基因组序列与载体连接，酶切，筛选得到阳性克隆，即为肠道病毒71型的感染性克隆。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗敏，张仁利，卢智刚，冼慧霞，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：