一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体技术

本发明专利技术公开了一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体，所述定向克隆的方法包括：设计并合成酶切盒、构建T载体、形成两端带有突出的dT的线性化的T载体、生成目标基因PCR片段、构建含有目标基因的重组载体。本发明专利技术定向TA克隆技术可用作制备高效的定向克隆的T载体，在分子生物学实验中广泛应用于PCR产物的克隆和表达。由于本发明专利技术改造的是表达载体，PCR产物可直接连接该载体，经单酶切鉴定后确定目的基因的连接方向，即可转入细胞内进行表达，而无需通过传统的测序等繁琐步骤才能确定连接方向，以简单快捷的方法实现定向克隆，一步构建出工程菌，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体。
技术介绍
PCR是目前体外基因扩增最常用的方法，对PCR产物进行快速有效的克隆，是开展基因保存、扩增，测序以及表达的有效方法。为此，国内外许多学者探索了很多不同的克隆方法。常用的方法有非定向克隆和定向克隆，这两种方法都建立了相应载体，不过这些现有的克隆载体虽然都能够达到克隆的目的，但是也各有一定的不足之处。T载体快速高效克隆PCR产物的明显优势显示了其在构建各种基因文库中的应用前景，由于载体3 ’端各有一个突出的3 ’ dT残基，恰好可与PCR产物末端由于Taq DNA聚合酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的dA(脱氧腺苷)互补配对，这种以粘性互补配对连接到载体上，称为T-A克隆，具有操作简单、快速高效、阳性克隆比例高等优点，从而大大提高PCR产物的连接效率。然而，T载体也有一定的不足之处，由于载体与PCR产物两端均是T-A连接，因此PCR产物可能正向连接或反向连接载体，无法实现定向克隆，需经送样测序后方可知产物与载体连接方向。目前商业化的T载体如pMD-18T，pGEM-T等均是是克隆型载体，仅能克隆扩增DNA片段，测序等功能，不能用于表达蛋白，另外还存在载体易发生自连，阳性克隆难以筛选等问题。T载体按照功能可分为克隆型T载体与表达型T载体，目前市场上供应的T载体主要是克隆型T载体，具有克隆目的基因的功能，仅满足扩增和测序的需要。若要表达目的基因，还需要将目的基因重组至表达载体中。表达型T载体同时满足基因克隆和表达的需要，可直接连接目的基因进行蛋白质表达分析，操作简便，避免过多操作步骤影响目的基因的序列。但是制备高效表达型T载体有很多难点。克隆型T 载体无需顾及目的DNA片段的连接方向，只需有复制起点、筛选标记即可，而表达型T载体除了上述要素外，还需要转录/翻译的必要元件-启动子，终止子等，另外必须顾及上下游的表达调控元件，它们均需要严格的方向次序排列。由于表达型T载体与目的基因PCR片段连接两端仍然是是同样的 T-A连接，同样目的基因PCR片段与载体可发生正向或反向连接的情况，不能以确定的方式连接，基因表达要求目的基因必需以正确的方向连接方可表达出目的蛋白，所以，基因PCR 片段与载体连接后必需先转入细胞，挑取一批单克隆菌株进行培养，表达前必须送样测序， 等待测序结果时间较长，不仅拖延实验的进度，而且耗费大量的人力物力，需要从众多测序结果中经过序列比对确认目的基因的连接方向，方能进行表达，这大大增加了研究开发的困难。由于上述的问题限制了表达型T载体应用范围，目前市面上仅有少数的几种表达型 T载在售，并且因为上述各种原因导致极少人愿意采用。因此，现有技术有待于完善和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体，利用可变限制性内切酶Xcm I制备出可进行高效快捷的能定向克隆T载体，旨在解决现有T载体不能进行定向克隆的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下在本专利技术中，提供一种定向克隆的方法，是一种T-A定向克隆方法，其具体包括以下步骤设计并合成酶切盒所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点；构建T载体将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的 T载体；形成两端带有突出的dT的线性化的T载体采用Xcm I内切酶对所述第二表达载体进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T载体；生成目标基因PCR片段将目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端加入一个与T载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个；构建含有目标基因的重组载体用T4连接酶把目标基因PCR片段与T载体连接起来构成含有目标基因的重组载体。所述定向克隆的方法，还包括以下步骤转化和鉴定将所述含有目标基因的重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，通过涂抗性平板得到单克隆菌落，挑取单克隆菌落进行扩大培养，然后提取质粒，再用限制性内切酶进行单酶切鉴定，确定目标基因的连接方向；其中，转化和鉴定步骤中所述的限制性内切酶为生成目标基因PCR片段步骤中所述的限制性内切酶位点所对应的限制性内切酶。具体地，所述设计并合成酶切盒步骤中，包括以下步骤 合成标记基因，所述标记基因用于鉴定和筛选所述酶切盒是否成功地扩增出所述酶切盒；在所述标记基因的两端添加多个酶切位点；其中，所述标记基因的两端均添加有一 Xcm I内切酶酶切位点；扩增所述酶切盒片段，并进行鉴定通过PCR扩增所述酶切盒片段，并进行电泳鉴定。所述构建T载体步骤中，包括以下步骤将所述酶切盒片段与pMD-19T载体相连，得到带有所述酶切盒的第一重组载体；将所述第一重组载体转化到感受态细胞中，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第一重组载体；对载体和所述第一重组载体分别用同样的限制性内切酶进行双酶切；其中，进行双酶切所采用的限制性内切酶不是Xcm I内切酶；回收所述第一重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体；将所述重组载体切除的酶切盒片段和酶切后的载体进行连接，形成第二重组载体；将第二重组载体转化至感受态细胞，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第二重组载体；对所述第二重组载体用同样的限制性内切酶进行双酶切酶切鉴定，经鉴定正确后，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体。其中，所述载体可以为克隆型以及表达型载体。所述载体可以原核表达载体或真核表达载体。所述生成目标基因PCR片段步骤中，具体地为将目标基因片段用PCR扩增方法在5’端加入一个与T载体的3’端所对应相同的限制性内切酶位点，或是，将目标基因片段用PCR扩增方法在3’端加入一个与T载体的5’ 端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个。本专利技术中还提供一种载体的改造方法，其具体包括以下步骤设计并合成酶切盒所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点；构建T载体将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的 T载体。所述载体的改造方法还包括以下步骤将所述T载体用Xcm I内切酶进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T 载体。另外，本专利技术中还提供一种T载体，所述T载体为具有定向克隆功能的T载体，是采用上述的表达载体的改 造方法对现有表达载体进行改造得到的。其中，所述现有表达载体包括克隆型载体以及表达型载体。本专利技术所提供的T-A定向克隆技术能广泛用于PCR产物的直接定向克隆，具有很高的应用价值，有以下几方面的积极效果1、PCR产物无需酶切、纯化，连接载体后用单酶切确定连接方向，以简单快捷的方法实现定向克隆，然后直接进行表达，节省宝贵的研究时间。而且，本专利技术所构建T载体无需事先进行双酶切，纯化回收等各种步骤，制备方法简单一步到位，与传统的定向克隆和T-A克隆方法相比具有明显优势。2、操作简化，重组载体经单酶切鉴定连接方向后即可立即进行蛋白表达的等工作。3、与传统方法相比，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定向克隆的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：设计并合成酶切盒：所述酶切盒的两端带有Xcm?I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点；构建T载体：将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm?I内切酶酶切位点的T载体；形成两端带有突出的dT的线性化的T载体：采用Xcm?I内切酶对所述第二表达载体进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T载体；生成目标基因PCR片段：将目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端加入一个与T载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个；构建含有目标基因的重组载体：用T4连接酶把目标基因PCR片段与T载体连接起来构成含有目标基因的重组载体。

【技术特征摘要】
1.一种定向克隆的方法，其特征在于，具体包括以下步骤 设计并合成酶切盒所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点； 构建T载体将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体； 形成两端带有突出的dT的线性化的T载体采用Xcm I内切酶对所述第二表达载体进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T载体； 生成目标基因PCR片段将目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端加入一个与T载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个； 构建含有目标基因的重组载体用T4连接酶把目标基因PCR片段与T载体连接起来构成含有目标基因的重组载体。2.根据权利要求1所述的定向克隆的方法，其特征在于，所述定向克隆的方法还包括以下步骤 转化和鉴定将所述含有目标基因的重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，通过涂抗性平板得到单克隆菌落，挑取单克隆菌落进行扩大培养，然后提取质粒，再用限制性内切酶进行单酶切鉴定，确定目标基因的连接方向； 其中，转化和鉴定步骤中所述的限制性内切酶为生成目标基因PCR片段步骤中所述的限制性内切酶位点所对应的限制性内切酶。3.根据权利要求1所述的定向克隆的方法，其特征在于，所述设计并合成酶切盒步骤，包括以下步骤 合成标记基因，所述标记基因用于鉴定和筛选所述酶切盒是否成功地扩增出所述酶切盒; 在所述标记基因的两端添加多个酶切位点，其中，所述标记基因的两端均添加有一 XcmI内切酶酶切位点； 通过PCR扩增所述酶切盒片段。4.根据权利要求1所述的定向克隆的方法，其特征在于，所述构建T载体步骤中，包括以下步骤 将所述酶切盒片段与PMD-19T载体相连，得到带有所述酶切盒的第一重组载体； 将所述第一重组载体转化到感受态细胞中，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第一重组载体； 对载体和所述第一重组载体分别用同样的限制性内切酶进行双酶切； 回收所述第一重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体； 将所述重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体进行连接，形成第二重组载体； 将第二重组载体转化至感受态细胞，培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：田生礼，梁志成，梁秀怡，刘士德，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：