一种改造的克隆载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种改造的克隆载体及其应用。本发明专利技术的改造的克隆载体，为环状克隆载体，为将pUC57载体的多克隆位点采用EcoRV、SmaI和StuI三个平端克隆位点替代，并去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点获得，所述改造的克隆载体仅有EcoRV、SmaI和StuI三个克隆位点。本发明专利技术的载体完全可以取代任何一种克隆载体而存在，使用方便，用途广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种克隆载体，尤其是一种方便基因克隆工作的载体。
技术介绍
目前分子生物学领域常用的克隆载体分为两种；一种是有大量多克隆位点的环状克隆载体，一种是没有多克隆位点的线性T载体。但是他们均有一定的使用限制。有多克隆位点的环状克隆载体，以pUC57为例，它的多克隆位点中包含有EcoRI, HindIII等常用酶切位点，但毕竟不能包含所有的酶切位点，比如常用的Notl，XhoI等，而往往插入的目的基因要使用这些没有的酶切位点，因此双酶切克隆就受到了一定的限制，除非在目的基因两端额外增加酶切位点。倘若使用平端克隆的话，有时候目的基因上又有载体上本身的酶切位点，这就造成了最终构建的重组质粒中有多个酶切位点，酶切位点的唯一性受到影响，会对后续的实验造成一定的影响。线性T载体克隆，以pMD18-T simple为例，T载体只能克隆有A尾巴的PCR产物，而现今高保真酶(如PFU)的使用越来越普及，而用PFU扩增的产物均是平末端的，这给TA克隆带来了一定的麻烦。同时线性载体无法大量复制，因此技术和费用上往往受限于生产厂家，不能做到自给自足。另外，这个载体并不是去掉了全部常用的酶切位点，比如IacZ基因内部的NdeI就没有去掉，而往往这个位点对表达载体的构建是重要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的缺陷，提供一种改造的克隆载体及其应用。本专利技术改造的克隆载体为没有任何常用克隆位点的环状克隆载体，本专利技术的克隆载体提供了一种全新的克隆方式。本专利技术一方面提供了一种改造的克隆载体，为环状克隆载体，为将PUC57载体的多克隆位点采用EcoRV、SmaI和StuI三个平端克隆位点替代，并去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点获得，所述改造的克隆载体仅有EcoRV、SmaI和StuI三个克隆位点。进一步的，所述改造的克隆载体中，将pUC57载体中序列为SEQ ID N0.2的LacZ序列及其互补序列替换为序列为SEQ ID N0.3的LacZ序列及其互补序列。进一步的，所述去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点的方法为对NdeI位点做同义突变。最佳的,所述改造的克隆载体的全长序列为SEQ ID N0.1。本专利技术第二方面提供了所述改造的克隆载体在基因工程领域的应用。 本专利技术第三方面提供了一种克隆载体的构建方法，包括下列步骤:I)酶切:采用EcoRV、SmaI或StuI酶切前述改造的克隆载体；2)连接:在连接酶的作用下，酶切后的克隆载体与平端线性目的基因连接成环。进一步的，所述酶切与连接在同一个体系中完成。本专利技术的克隆方法酶切后不需要酶切产物回收步骤。本专利技术克隆方法的原理是:同一个体系中，内切酶将载体切成线性，在连接酶的作用下，目的基因与载体连接成环，而成环的分子已经没有该内切酶的识别位点了，可以稳定存在。而载体自身成环的则继续被内切酶消化成线性，直到所有载体都连上目的基因为止。目的基因上同时含有EcoRV SmaI StuI位点的可能性很小，因此总有一个平端酶适合于平端克隆。本专利技术的克隆载体相比现有载体的优点在于:a)该载体完全可以取代任何一种克隆载体而存在，使用方便，用途广。这对任何一个生物学实验室都是很有利的。b)大大降低了工作成本:本专利技术的克隆载体作为一个环状质粒，可以像其他质粒一样，转化到大肠杆菌中长期保存、大量复制，这对于一个实验室来说很重要，因为这样一个克隆载体可以取之不尽，用之不竭。每一个生物学实验室都是有条件保存和抽提质粒的，只要简单的抽提一次质粒完全可以使用半个月甚至一年。一支530元的pMD18-Tsimple,仅仅只够完成10个TA克隆，而一个实验室有时候一天就要克隆不下于10个克隆。由此可见，使用PUCK载体降低的成本不可小觑，当然这还没有把PCR产物加A的费用计算在内。c)克隆操作更为简单:本专利技术的克隆载体上没有任何常用的粘性末端酶切克隆位点，但有3个常用的平端克隆位点，再在本专利的平端克隆技术的帮助下，基本可以满足所有PCR产物的平端克隆，只需要用平端酶酶切本专利技术的克隆载体，之后与平端DNA产物混合连接即可，酶切和连接可以在同一个体系中完成，减少了酶切回收的步骤；克隆操作更为简单，克隆时，无需在目的基因两端额外增加酶切位点。d)大大降低了后续工作的难度:接下来从克隆载体中切下目的基因时，可以避免载体上与目的基因两端相 同的酶切位点因为酶切不完全而影响到后续亚克隆操作。且由于载体中只有三个平端克隆位点，而目的基因上同时含有EcoRV SmaI StuI位点的可能性很小，因此最终构建的重组质粒中酶切位点的唯一性容易保证，便于后续操作。附图说明图1空克隆载体的转化验证结果图2插入目的片段验证筛选效果结果图3载体pUCK全图具体实施例方式以下列举具体实施例以进一步阐述本专利技术，应理解，实例并非用于限制本专利技术的保护范围。实施例1载体构建以pUC57载体作为修改母本，将LacZ序列中的所有酶切位点做调整。去掉多克隆位点中的所有位点，更换为EcoRV SmaI StuI三个平端克隆位点，去掉LacZ下游的NdeI酶切位点，最终得到一个只有EcoRV SmaI StuI可用的重组质粒(以下简称载体pUCK)。克隆载体pUCK的设计思路和技术路线如下:1、LacZ序列设计。载体pUC57中的LacZ序列为SEQ ID N0.2,修改后的LacZ序列为SEQ ID N0.3，本专利技术是将pUC57中的LacZ上游的多克隆位点去掉，更换成了三个平端克隆位点EcoRV SmaI StuI，同时对NdeI做了同义突变。确保LacZ基因能够顺利表达，并行使正常功能。SEQ ID N0.2pUC57 中的 LacZ 348bp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改造的克隆载体，为环状克隆载体，为将pUC57载体的多克隆位点采用EcoRV、SmaI和StuI三个平端克隆位点替代，并去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点获得，所述改造的克隆载体仅有EcoRV、SmaI和StuI三个克隆位点。

【技术特征摘要】
1.种改造的克隆载体，为环状克隆载体，为将PUC57载体的多克隆位点采用EcoRV、SmaI和StuI三个平端克隆位点替代，并去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点获得，所述改造的克隆载体仅有EcoRV、SmaI和StuI三个克隆位点。2.权利要求1所述改造的克隆载体，其特征在于，所述改造的克隆载体中，将PUC57载体中序列为SEQ ID N0.2的LacZ序列及其互补序列替换为序列为SEQ ID N0.3的LacZ序列及其互补序列。3.权利要求1所述改造的克隆载体，其特征在于，所述去掉PUC57载体中LacZ...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔凡静，王素莲，王乾，庄慧忠，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：