一种表达IL‑6的重组K562工程细胞的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种表达IL‑6的重组K562细胞的构建方法。本发明专利技术通过克隆IL‑6序列，基于此构建克隆载体pMD18‑T‑IL‑6和表达载体pCMV3‑N‑GFP‑IL‑6，然后将pCMV3‑N‑GFP‑IL‑6质粒转染K562细胞，使IL‑6蛋白在K562细胞中表达后锚定于细胞膜表面，进而检测绿色荧光在K562细胞中表达位置，最终获得表达IL‑6蛋白重组K562细胞。本发明专利技术成功构建了表达IL‑6的重组K562工程细胞，为后续NK细胞的扩增实验奠定了坚定的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种表达IL-6的重组K562工程细胞的构建方法。
技术介绍
白细胞介素6，即IL-6，分子量19-28kDa的糖蛋白。人IL-6基因位于7p，有5个外显子和4个内含子。人和小鼠IL-6的氨基酸序列有42％同源性，IL-6与G-CSF也有同源性。其来源于多种细胞，在急性期反应、免疫应答、造血和神经系统等方面发挥着多种生物学活性。IL-6具有抗肿瘤效应，间接、直接增进了NK细胞、CTL细胞杀伤肿瘤的活性。IL-6与浆细胞瘤形成有密切关系，慢性炎症诱导IL-6生物合成增加与浆细胞瘤的发生存在明显关系。在机体外，白细胞介素6可促进骨髓瘤细胞、浆细胞瘤生长，IL-6对某些浆细胞瘤的生长发挥着重要作用。可通过自分泌机理调节，与慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性髓系白血病(AML)的发病有关，血清中IL-6的水平与多发性骨髓瘤病情严重程度有关。多发性骨髓瘤患者不仅骨髓细胞表面IL-6R表达增加，而且血浆中sIL-6R水平明显升高。对其mRNA和碘化重组IL-6特异结合位点的存在进行研究，发现大部分细胞系均表达IL-6蛋白，但K562和HEL，Dami除外(NavarroS1，MitjavilaMT，KatzA，DolyJ，VainchenkerW.Expressionofinterleukin6anditsspecificreceptorbyuntreatedandPMA-stimulatedhumanerythroidandmegakaryocyticcelllines.)。因此，只有KU812和MEG-01共表达两者的IL-6和IL-6-R。佛波酯(PMA)肉豆蔻酯治疗后，所有的细胞系中表达或过度表达IL-6。在红白血病K562细胞株中，il-6-r诱导前是不检测的，但及时表达PMA刺激后，表明PMA诱导的K562细胞的新特征可能是IL-6介导的。IL-6诱导巨噬细胞、神经细胞和NK细胞分化，协同IL-3促进干细胞分化和巨核细胞成熟。NK细胞是体内重要的淋巴细胞亚群，是体内第一道防线，因其不需要初次免疫活化，在过继治疗方面前景广大。所以，采用体外扩增的方式得到大量NK细胞是近年研究热点。国内外学者研究发现除了细胞因子刺激，K562、HFWT等肿瘤细胞也可刺激NK细胞大量扩增。Guo等人证明NK细胞与K562细胞长时间接触，双方会发生免疫编辑作用，且由于细胞表面相应配体的改变，导致NK细胞杀伤力下降(郭坤元等.NK细胞与K562细胞之间相互免疫编辑作用及其对NK细胞杀伤活性的影响)。NK细胞在杀伤肿瘤细胞过程扮演重要角色，因此构建重组K562工程细胞刺激NK细胞，以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增对象，使NK细胞在体外环境下大量扩增，进而为研究K562细胞对NK细胞增殖、表型和功能的研究创造条件，在肿瘤基因治疗、NK细胞免疫治疗等方面奠定基础。近年研究表明，IL-6与白血病密切相关，人白血病细胞自分泌IL-6保持自主性生长。急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者血清中IL-6的水平均高于正常人。NK细胞体外增殖过程中需要多种细胞因子作用，这些细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN-g以及CD3McAb等多种。由于NK细胞受到各种活化受体影响导致体外扩增难，细胞毒性降低，本专利技术通过表达IL-6蛋白K562细胞体外刺激可进行大规模NK细胞培养，该种技术手段打破以往IL-2和IL-15同时表达在K562细胞，以此刺激NK细胞的方式(FujisakiH，KakudaH，ShimasakiN，etal.Expansionofhighlycytotoxichumannaturalkillercellsforcancercelltherapy)，打破临床应用的瓶颈。本专利技术成功构建了克隆载体pMD18-T-IL-6，及表达载体pCMV3-N-GFP-IL-6，获得稳定遗传单克隆化的K562细胞株，荧光显微镜下检测到绿色荧光蛋白主要于胞核表达，与生物信息学预测一致。表达IL-6的重组K562工程细胞的构建成功，为后续NK细胞的扩增实验奠定了坚定的基础。
技术实现思路
本专利技术公开了一种表达IL-6的重组K562工程细胞及构建方法。本专利技术通过克隆IL-6序列，基于此构建克隆载体pMD18-T-IL-6和表达载体pCMV3-N-GFP-IL-6。然后以脂质体转染的方式将pCMV3-N-GFP-IL-6质粒转染K562细胞，使IL-6蛋白在K562细胞中表达后锚定于细胞膜表面。进而检测绿色荧光在K562细胞中表达位置，最终获得表达IL-6蛋白重组K562细胞。本专利技术公开还公开了一种表达IL-6的重组K562细胞的构建方法，包括以下步骤：(1)克隆人IL-6DNA序列，获得目的DNAIL-6的基因；(2)将IL-6基因片段与克隆载体pMD18-T连接，构建克隆载体pMD18-T-IL-6，双酶切克隆载体pMD18-T-IL-6，获得目的基因；(3)将目的基因与同样双酶切处理的表达载体pCMV3-N-GFP连接，构建表达载体pCMV3-N-GFP-IL-6；(4)将表达载体pCMV3-N-GFP-IL-6转染K562细胞，获得表达IL-6的重组K562细胞。所述步骤(1)中采用RT-PCR法克隆IL-6基因序列，采用的引物为：上游引物5’-CTTGCCATAGCCAGCTCTTCTTC-3’，下游引物5’-CGTGTCTAAGCAGCAGAGTGATG-3’。所述RT-PCR法具体扩增步骤为：根据人IL-6cDNA的5′端序列设计引物对进行梯度PCR筛选，从而获得最佳退火温度61℃，最适反应条件如下：42℃反应60min，然后95℃，10min灭活逆转录酶，4℃保存；PCR产物由2％琼脂糖凝胶电泳检测，最终确定最佳退火温度60.5℃；在最佳退火温度下进行PCR扩增，获得目的DNAIL-6的基因。步骤(2)中所述的酶为SfiI和NotI。步骤(4)中所述的转染为脂质体转染方式。本专利技术还公开了所述构建方法过程中所获得的克隆载体pMD18-T-IL-6，具体结构如图1所示。本专利技术还公开了所述构建方法过程中所获得的表达载体pCMV3-N-GFP-IL-6，具体结构如图2所示。本专利技术还公开了所述构建方法获得的表达IL-6的重组K562细胞。本专利技术还公开了所述重组K562细胞在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。附图说明图1为pMD18-T-IL-6结构图。图2为pCMV3-N-GFP-IL-6结构图。图3获得K562细胞结果图。图4为pMD18-T-IL-6重组质粒鉴定。图5为利用人类基因组草图搜索法分离IL-6基因5′末端的PCR产物。图6IL-6基因阅读框序列探针标记结果：1，标记探针；2，对照(未标记探针)；M，分子量标记。图7IL-6基因cDNA全长的克隆与NCBI中的NR数据库比较结果。图8EGFP蛋白在K562细胞株中的表达。具体实施方式：下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。下述实施例中所述实验方法如无特殊说明均为常规实验方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。K562细胞购自中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种K562细胞，其特征在于，所述K562细胞是一种表达IL‑6的重组K562细胞，是通过克隆人IL‑6序列，构建克隆载体pMD18‑T‑IL‑6和构建表达载体pCMV3‑N‑GFP‑IL‑6，然后将pCMV3‑N‑GFP‑IL‑6质粒转染K562细胞获得的重组细胞。

【技术特征摘要】
1.一种K562细胞，其特征在于，所述K562细胞是一种表达IL-6的重组K562细胞，是通过克隆人IL-6序列，构建克隆载体pMD18-T-IL-6和构建表达载体pCMV3-N-GFP-IL-6，然后将pCMV3-N-GFP-IL-6质粒转染K562细胞获得的重组细胞。2.如权利要求1所述K562细胞的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)克隆人IL-6DNA序列，获得目的DNAIL-6的基因；(2)将IL-6基因片段与克隆载体pMD18-T连接，构建克隆载体pMD18-T-IL-6，双酶切克隆载体pMD18-T-IL-6，获得目的基因；(3)将目的基因与同样双酶切处理的表达载体pCMV3-N-GFP连接，构建表达载体pCMV3-N-GFP-IL-6；(4)将表达载体pCMV3-N-GFP-IL-6转染K562细胞，获得表达IL-6的重组K562细胞。3.根据权利要求2所述K562细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用RT-PCR法克隆IL-6基因序列，采用的上游引物为5’-CTTGCCATAGCCAGCTCTTCTTC-3’，下游引物为5’-CGTGTCTAAGCAGCAGAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴树才，杨永辉，郭素敏，高莉，
申请(专利权)人：吴树才，杨永辉，郭素敏，
类型：发明
国别省市：河北;13