本发明专利技术涉及一种新的源于晚期胃印戒细胞癌细胞株gc‑006‑03及其建立方法和应用，所述细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2016152。本发明专利技术的胃印戒细胞癌细胞株gc‑006‑03能够稳定传代，为今后研究胃印戒细胞癌的发生、发展转移，进而揭示胃印戒细胞癌的发病机制提供一定的研究线索和实验模型。同时，建立gc‑006‑03细胞株不仅为胃癌分子生物学、免疫学及临床综合诊治等研究提供了有利条件，而且为筛选防治胃癌药物提供了方便的平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种源于人晚期胃印戒细胞癌的细胞株及其建立方法和应用。
技术介绍
胃癌是严重危害人民群众健康的消化道恶性肿瘤。据文献报道，全世界范围内，胃癌新发病例989,600人，占全世界癌症新发病人数的8％；由胃癌导致的相关死亡人数738,000人，占全世界癌症死亡人数的10％。超过70％的新发病例及死亡病例发生在发展中国家。东亚地区胃癌发病率居世界第一。我国是胃癌的高发地区，每年新发胃癌患者达30～40万人，死亡人数达30万人，占恶性肿瘤死亡人数的23％。近年来，胃癌的发病年龄具有年轻化趋势，过去以40岁～60岁年龄组居多，现在则以35岁～55岁年龄组为多。肿瘤细胞系/株的建立，为进一步研究肿瘤发生、浸润转移机制﹑抗癌药物筛选等提供了方便和相对价廉的细胞模型。目前世界范围内报道的胃癌细胞系已经不少，例如：日本的MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74等9株；韩国的SNU-1、SNU-5、SNU-16等16株；美国ATCC是比较权威的细胞库，常销售的胃癌细胞株有6株，其中4株来源日本南韩的亚裔人群。中国是胃癌高发国家，但目前只有三株胃癌细胞被广泛利用作为肿瘤发生机制的深入研究，分别是BGC823、SGC-7901和MGC803，而且它们已被传代了20-30年。因此，更多地建立新的我国特色的胃癌细胞株，并利用其进行我国胃癌发病机制的研究尤为重要。胃印戒细胞癌是胃癌中的一种特殊类型，以细胞黏液分泌为特点，与其他组织学类型胃癌相比，印戒细胞癌多呈弥漫浸润性生长，好发于年轻女性、侵袭力强、预后差。由于胃印戒细胞癌在超微结构、病理表现、功能分化表型、等相关肿瘤分子生物学方面均有其特殊性。目前在有限的胃癌细胞株中，胃印戒细胞癌细胞株实为稀有，因此迫切需要寻找典型的胃印戒细胞癌细胞，用于进行胃癌发生、浸润转移机制的深入研究。由于肿瘤具有异质性、复杂性、以及由不同种族和地域带来的差异性等特点，即使是用相同肿瘤原代培养建立起来的细胞系/株，因其背景来源不同，得出的相关研究也可能不能完全反映相应疾病的全部特点。而且，许多肿瘤细胞系/株会随培养时间的延长或培养环境的变化而发生特性改变，甚至完全失去其本来特性，特别是大多数胃癌细胞系/株受限于成瘤率低或均一性差等问题，难以应用于大规模异种移植瘤模型的药物筛选。因此，不断进行肿瘤细胞原代培养研究，建立更多的胃癌细胞系/株是非常必要的。
技术实现思路
针对上述我国人胃癌细胞系/株生物多样性低，与临床胃癌的生物学性状相差较大等不足，本专利技术目的在于提供一种新的源于晚期胃印戒细胞癌细胞株gc-006-03。该细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心)，保藏编号为CCTCCNO：C2016152，保藏日期为2016年8月9日，分类命名：人胃印戒细胞癌细胞株。本专利技术gc-006-03细胞株其性状稳定，可稳定传代>100代，成瘤率高，潜伏期短，均一性好，为胃癌研究提供了一种新的临床肿瘤生物学特性的实验材料。本专利技术的细胞株取自一名55岁女性胃印戒细胞癌患者的腹水，采用percoll溶液分离技术，经体外细胞扩增传代培养，建立胃印戒细胞癌细胞系gc-006。在分离细胞株时，采用先低浓度细胞在大平皿中生长，培养7-10天后，细胞生长旺盛，而且成分散的单克隆状，再行挑选单克隆细胞。被挑选的克隆先在poly-L-sine包被的24孔板中培养，使细胞容易贴壁成活。进而获得高纯度的细胞株，命名为gc-006-03。该细胞株具有以下生物学特性：1、细胞贴壁生长，无接触抑制，呈叠加生长；2、细胞倍增时间接近36小时；3、细胞株具有很强的克隆形成能力，琼脂集落形成率为70％；种板效率88％；4、细胞免疫组化结果显示：本细胞呈角蛋白(+++)、波形蛋白(-)、ck7(2+)、ck20(-)、ttf1(-)、Li-cad(+)、cdx2(2+)、CEA(3+)、Ki-67染色阳性率约45％；5﹑流式检测CD326+>98％：该结果显示gc-006-03是上皮源细胞，及其它的高度均一性。6、染色体分析提示：本株细胞为稳定的亚三倍体细胞株，染色体分布在38-54，亚三倍体占82.9％，其中50、51、52、53条染色体的细胞占58.5％，具有双着丝点，异位及衍生现象；7、成瘤率高：裸鼠接种本细胞5只后全部成瘤；8﹑短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)结果：该结果在与ATCC﹑DSMZ﹑JCRB和国家实验资源细胞共享平台中进行细胞STR比对，均未发现gc-006-03的同源细胞。说明该细胞是唯一的。本专利技术另一目的在于提供一种分离贴壁生长的单细胞株的方法，所述方法包括如下步骤：1.胰酶消化：新细胞系胰酶消化需摸索试验条件，如胰酶浓度和消化时间。因为,过度消化则影响细胞活性，消化不够则细胞成团；2.终止消化：待细胞变圆，轻拍培养瓶，使细胞脱落。迅速加入10-20倍的含血清培养基或HBSS液(含钙镁的Hank’s液)终止消化；3.接种细胞：根据预测的克隆形成率，将候选细胞做系列稀释，以100-2000个/皿的范围分别接种在几个10cm中，轻轻吹打分散；4.培养：细胞置2-10％CO2，95湿度，37℃培养7-15天，一般不需要换液，此时细胞呈分散的单克隆状，并且生长富有活力；5.挑选单克隆：集落形成过程中定期用显微镜观察，确定其克隆起源，选择克隆比较分散的区域，做好记号，去除部分培养液，用1ml枪头直接挑取克隆，无需加胰酶,以减少对细胞的损伤；6.扩增培养：挑取目的克隆先接种于poly-L-sine包被的24孔板中进行培养，这样细胞易贴壁成活。每隔3-5天进行半量换液，细胞长满瓶底的80-90％及时传代，然后逐渐扩增培养，形成足够量的单克隆细胞株。常规分离细胞株均采用微量滴定培养板进行克隆，然而微量滴定培养板操作繁杂，而且细胞在单一个体时不易成活。本专利技术的方法采取先将gc-006细胞系的细胞做系列稀释，以100-2000个/皿的范围分别接种在5个10cm中，以10％胎牛血清的1640培养基进行培养，置37℃，5％CO2培养箱中培养7-10天。此时细胞呈分散的单克隆状，并且生长旺盛。这时再进行精准单克隆细胞挑选，挑取克隆时无需加胰酶，尽可能减少细胞损伤。挑出的克隆细胞先在poly-L-sine包被的24孔板中培养，使细胞易贴壁成活。然后逐渐扩增培养。通过上述方法，成功地建立了本专利技术的能够连续传代的高纯度的胃印戒细胞癌细胞株gc-006-03。本专利技术还有一个目的在于提供gc-006-03胃印戒细胞癌细胞株的应用。所述应用包括但不限于：体外或体内(动物)筛选防治胃癌药物；研究胃癌的发生机理；建立胃癌发生、发展或转移的细胞模型；建立胃癌动物模型；研究胃癌分化机制、细胞形态及功能异常、肿瘤浸润转移机制和指导临床综合诊治的细胞模型。模型的建立方法和具体应用都是本领域已知的，可根据具体情形设计使用。本专利技术的有益效果如下：通过提供一种新型稳定传代的胃印戒细胞癌细胞株gc-006-03，为今后研究胃印戒细胞癌的发生、发展转移，进而揭示胃印戒细胞癌的发病机制提供一定的研究线索和实验模型。同时，建立gc-006-03本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种源于晚期胃印戒细胞癌细胞株gc‑006‑03，所述细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2016152。
【技术特征摘要】
1.一种源于晚期胃印戒细胞癌细胞株gc-006-03，所述细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2016152。2.如权利要求1所述的细胞株gc-006-03在筛选防治胃癌药物中的应用。3.如权利要求1所述的细胞株gc-006-03在研究胃癌的发生机理中的应用。4.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈锦飞，薛毅琪，洪灵芝，霍新颖，陈红，韦栋平，
申请(专利权)人：南京医科大学附属南京医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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