膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及筛选肿瘤组织特异性结合肽，具体为一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽及其应用，命名为NYZL1，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示， 以及膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽在制备膀胱癌药物中的应用，本发明专利技术利用噬菌体展示技术，以我国第一株自建人膀胱癌细胞BIU87为靶细胞，筛选出与人膀胱癌BIU87细胞特异性结合的噬菌体克隆，获得能与人膀胱癌靶向结合的氨基酸序列，本发明专利技术采用荷瘤动物模型进行完全体内筛选，最大限度的模拟膀胱癌组织中的实际内环境，借助自身组织、器官为对照，丰富了筛选靶蛋白的范围，提高筛选的特异性，为膀胱癌早期诊断、抗肿瘤药物制备提供一定的理论依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，涉及筛选肿瘤组织特异性结合肽，具体为一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽及其应用。
技术介绍
膀胱癌（Bladder carcinoma）是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其中75%-85%为浅表性膀胱肿瘤，又称为非肌肉浸润性肿瘤（Non muscle invasive bladder tumor，NMIBC）。虽然采取膀胱癌手术及术后综合疗法显著提高了患者5年生存率，但因膀胱癌早期血尿常可自行减轻或停止，易给患者造成“好转”或“治愈”的错觉而贻误治疗。因此，针对膀胱原位癌诊断困难、术中肿瘤不易识别和术后需膀胱镜复查的临床问题，积极寻找特异性强、阳性率高、能识别微小肿瘤的肿瘤标志物将是改变膀胱癌诊疗现状的有效手段之一。噬菌体展示技术于1985年由Sminth等首次创造性的提出，现已成为发现新功能多肽和改变已有多肽性质的有效工具，广泛应用于蛋白质工程和细胞生物学。其原理为通过将一定的外源蛋白质或多肽的基因表达产物融合到噬菌体衣壳蛋白PⅢ或PⅧ端,并在噬菌体颗粒表面展示该基因编码的蛋白,同时将遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中，从而在基因与蛋白质或多肽间建立直接联系。1996年，Pasqualini等在噬菌体展示技术体外筛选的基础上，发展了体内筛选方法。噬菌体展示技术体内筛选方法将噬菌体展示技术施以体内选择压力，进行肿瘤组织或其内部血管特异性配体的筛选,从而能够获得具有靶向作用的噬菌体表面展示的小分子多肽序列。因此，为实现膀胱癌微小肿瘤的分子诊断和靶向治疗，采用体内噬菌体展示技术筛选人膀胱癌的特异性靶向多肽标志物，为膀胱癌早期诊断和靶向治疗提供理论基础。目前，应用噬菌体展示技术体内筛选已得到针对不同肿瘤组织或血管的特异性靶向多肽配体，这些靶向多肽配体可显示肿瘤组织或血管，或利用特异靶向多肽配体阻断生长因子与受体结合，或携带细胞毒性药物攻击肿瘤组织，从而用于肿瘤诊断和治疗。Lee等通过T7噬菌体展示肽库筛选出人膀胱癌HT-1367细胞系特异性导向肽CSNRDARRC，并证实该肽对膀胱癌患者的尿液及病理组织有一定的结合特异性；赵扬等证明FITC标记肽CSNRDARRC可与膀胱癌T24细胞系及人膀胱癌患者病理组织相结合，但结合特异性有待提高。到目前为止未见有以人膀胱癌细胞BIU87为研究对象，并筛选出与其能进行特异性结合的多肽的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽及其应用，利用噬菌体展示技术筛选得到特异性结合多肽NYZL1，经过鉴定，与人膀胱移行细胞癌细胞系BIU87有较强亲和力和特异性。本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽，命名为NYZL1，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即5′-GCAATGACGACCAATCGGCGACGAACA-3′。一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，即Cys Ser Ser Pro Ile Gly Arg His Cys。一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽在制备膀胱癌药物中的应用。本专利技术利用体内噬菌体展示技术筛选与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽，首先将人膀胱移行细胞癌细胞BIU87接种于裸鼠体内，制备膀胱癌荷瘤小鼠模型，尾静脉注射噬菌体展示环七肽库，然后筛选与膀胱移行细胞癌特异性结合的含外源多肽的噬菌体，经过3轮体内筛选后,免疫组织化学法及ELISA法鉴定单克隆噬菌体对BIU87的亲和力。提取阳性单克隆噬菌体单链DNA进行测序，并推导出外源多肽氨基酸序列，化学合成多肽、制备分子探针后采用激光扫描共焦显微镜术及流式细胞术鉴定多肽对膀胱癌细胞和组织的特异性。结果 3轮体内筛选后，噬菌体富集率达到4.334×102倍，免疫组化结果显示，肿瘤组织中噬菌体肽的含量随着每一轮筛选呈增长趋势，且结合逐渐增强，同时由于噬菌体经肝、肾代谢，可见肝脏结合大量非特异性的噬菌体；ELISA结果显示，随机挑选的30个单克隆噬菌体斑中，有24个阳性噬菌体，其中10个噬菌体对BIU87有较强的亲和力，对其测序获得3种多肽序列，重复率最高的序列CSSPIGRHC(8/10)命名为NYZL1。对以上噬菌体克隆外源多肽进行生物信息学分析，序列由Ser、Pro、Ile、Gly、Arg、His六种氨基酸组成，两端以Cys通过二硫键连接成为构像稳定的小分子多肽，该序列与NCBI/BLAST、SwissProt等数据库中已知基因和蛋白无同源性，且国内外文献均未见报道。本专利技术通过激光扫描共焦显微镜术、流式细胞术进一步证实多肽NYZL1对膀胱癌细胞的特异性，显示人膀胱移行细胞癌细胞系BIU87表面有多肽NYZL1的特异性结合位点。本专利技术利用噬菌体展示技术，以我国第一株自建人膀胱癌细胞BIU87为靶细胞，旨在快速、高效的筛选出与人膀胱癌BIU87细胞特异性结合的噬菌体克隆，从而获得能与人膀胱癌靶向结合的氨基酸序列。相比体外培养的细胞，裸鼠移植瘤模型有着不可比拟的优势，目前已广泛应用于模拟人体内肿瘤发生、发展、转移机制等研究。本专利技术采用荷瘤动物模型进行完全体内筛选，最大限度的模拟膀胱癌组织中的实际内环境，借助自身组织、器官为对照，丰富了筛选靶蛋白的范围，同时采用活体心脏灌注生理盐水尽可能的减少体内非特异性噬菌体的残留，提高筛选的特异性，为膀胱癌早期诊断、抗肿瘤药物制备提供一定的理论依据。附图说明图1为接种人膀胱移行细胞癌BIU87细胞后的荷瘤裸鼠模型；图2为荷瘤裸鼠肿瘤组织HE染色(×200)荧光图；图3为免疫组化鉴定噬菌体肽库体内分布的免疫组织化学染色荧光图，其中A 为肿瘤组织空白对照染色；B为第一轮筛选肿瘤组织中噬菌体染色；C为第二轮筛选肿瘤组织中噬菌体染色；D为第三轮筛选肿瘤组织中噬菌体染色；E为肝脏组织中噬菌体染色；F为肾脏组织中噬菌体染色；G为肺组织中噬菌体染色；H为肌肉组织中噬菌体染色；箭头所指为DAB 阳性染色。图4为单克隆噬菌体对BIU87的亲和力柱状图；图5为噬菌体R2、R6、R8、R11、R13、R14、R15、R30提取DNA后琼脂糖凝胶电泳图；图6为噬菌体R2、R6、R8、R11、R13、R14、R15、R30提取DNA测序结果；图7为 FITC-C6-NYZL1高效液相层析及质谱分析纯化图谱；图8为激光共焦显微镜鉴定FITC-C6-NYZL1对BIU87结合特异性的荧光图。具体实施方式结合以下具体实施例对本专利技术作进一步详细的说明。一、本专利技术实施例中所用实验材料及主要试剂如下：噬菌体展示环七肽库试剂盒（Ph.D.-C7CTM  Peptide Library Kit）购自NEW ENGLAND BioLabs，包括噬菌体展示环七肽库（～1×1013pfu/ml）；宿主菌E.coli ER2738;—96 gⅢ测序引物5′-HOCCC TCA TAG TTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽，命名为NYZL1，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即5′‑GCAATGACGACCAATCGGCGACGAACA‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽，命名为NYZL1，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即
5′-GCAATGACGACCAATCGGCGACGAACA-3′。
2.根据权利要求1所述的膀胱移行细胞癌细...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓峰，张帆，罗俊茜，
申请(专利权)人：山西医科大学第一医院，
类型：发明
国别省市：山西;14