本发明专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地提供了一种基于免疫磁颗粒的化学发光分析方法检测人膀胱癌细胞的试剂盒及其制备方法。根据本发明专利技术，本发明专利技术的试剂盒主要包括：1)膀胱癌EJ细胞标准品；2)由特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体包被的磁颗粒；3)酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体；4)3)中的酶所作用的化学发光底物；5)反应管或微孔板；6)与5)中的反应管或微孔板配套的磁分离器。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫分析以及临床诊断医学领域，具体地，本专利技术提供一种人膀胱癌细胞的化学发光检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤。血尿是膀胱癌患者临床早期症状之一，有肉眼血尿和镜检血尿。然而血尿在尿路炎症以及结石症状下也有发生，并不是膀胱癌的特异性症状。正是由于膀胱癌早期症状不明显，以至于发现有血尿，患者膀胱肿瘤一般发展为较大的肿瘤结节。寻找特异的膀胱癌诊断方法对早期膀胱癌诊断有重要的临床应用价值。膀胱癌的早期诊断方法有以下几种I)尿液分析血尿出现后的首先便是进行尿液分析，以便排除是否是由于尿路炎症引起，并不能确定患者是否患膀胱癌；2)尿脱落细胞分析对尿沉渣中的尿脱落细胞进行显微镜下观察，可以鉴别并区分恶化的肿瘤细胞和正常细胞。但灵敏度不高，早期膀胱癌容易被漏检；3)超声、CT或者MRI成像观察对肿瘤的大小和恶化程度可以直接进行图像观察，准确度较前面方法大大提高。尽管近年来成像技术的不断进步，灵敏度不断提高，但对较小的肿瘤观察仍然不够，易漏检；4)膀胱镜观察膀胱镜通过尿路进入膀胱，进行膀胱内可视观察，从而发现早期的肿瘤。能够检出2)、3)中漏检的大部分患者。目前早期诊断膀胱癌细胞特异性最高的是通过膀胱镜的观察，荧光膀胱镜的应用提高了检测灵敏度。但患者一般需要临床跟踪观察，从而能及早发现肿瘤发生或复发状况。然而，膀胱镜观察会对患者造成身体不适。另外，目前荧光膀胱镜检测所需荧光染料特异性不高，且对人体有一定的负面影响。因此，在膀胱癌的早期诊断方面，人们一直在探索更特异、灵敏的检测方法，尽可能的利用特异的肿瘤标志物实现方便、快速的检测。实现尿样中的膀胱癌标志物或者细胞的检测，进行实时检测在临床诊断方面具有重要的应用价值。目前商业化的可用的膀胱癌的标志物有人补体因子H相关蛋白(膀胱肿瘤抗原，BTA试剂盒)、高分子量的癌胚抗原和两个膀胱癌细胞相关的粘附分子(美国Scimedx Corp公司的Immunocyt试剂盒)、核基质蛋白22 (NMP22)、3、7和17号染色体的异倍体以及P16肿瘤抑制因子9p21位点的缺失(UroVysion试剂盒)。BTA是指人补充因子H相关蛋白，BTA检测需要专业操作人员在标准实验室进行，灵敏度达到57-83 %，特异性60-92%，血尿患者的特异性只能达到46%。另外良性前列腺增生、肾结石以及尿路感染等情况均影响BTA检测的特异性；Immunocyt试剂盒通过免疫荧光检测尿脱落细胞，尽管灵敏度以及特异性很高，但为了达到较高的准确性需要进行大量的尿脱落细胞检测，因此在膀胱癌病人的治疗以及预后观测方面具有很高的应用价值，但应用在早期诊断方面差强人意；其中NMP22是目前应用最广的膀胱癌标志物，ELISA试剂盒的市场化实现了膀胱癌早期诊断的方便、快捷检测，检测灵敏度和特异性也很高，但是在有病毒感染、肾/膀胱结石等情况下，仍会出现假阳性；UroVysion试剂盒采用的是多祀标的突光原位杂交(FISH)技术，尽管灵敏度与特异性得到极大提高，美国FDA批准，但与Immunocyt试剂盒类似，需要检测大量的尿脱落细胞。结合目前的膀胱癌标志物的应用以及膀胱癌的诊断现状得出一方面，新的特异的膀胱癌标志物仍是研究的重点，制备早期诊断试剂盒，实现快速检测，在膀胱癌的诊断方面具有重要的临床价值；另一方面，进行尿样中的细胞检测，避免炎症、血尿等非特异症状的影响，准确性最高。
技术实现思路
(一)解决的技术问题本专利技术着眼于膀胱癌的早期诊断与膀胱癌病人的跟踪观察，拟解决现行的膀胱癌诊断方面的难题，即采用特异的识别膀胱癌细胞两株单克隆抗体，实现膀胱癌细胞的双抗体识别与捕获，结合高灵敏的化学发光免疫分析方法，定量检测尿脱落膀胱癌细胞，不需要昂贵的检测仪器，便于临床推广，具有良好的市场应用价值，将会弥补市场现有试剂盒的不足。本专利技术的目的是提供一种特异的膀胱癌细胞捕获、识别方法，以及高灵敏检测试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种用于膀胱癌早期诊断、术后监测的试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。(二)技术方案 本专利技术具体提供以下试剂盒[I] 一种用于检测人膀胱癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括两种特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体。[2]根据[I]所述的试剂盒，所述试剂盒包括I)膀胱癌EJ细胞标准品；2)由特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体包被的磁颗粒；3)酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体；4)3)中的酶所作用的化学发光底物；5)反应管或微孔板，所述反应管或微孔板优选经过无蛋白封闭液的封闭处理，所述无蛋白封闭液为含有1. O %的鱼水解明胶，PH7. 2的O. 02M磷酸盐缓冲液；6)与5)中的反应管或微孔板配套的磁分离器。[3]根据[2]所述的试剂盒，其中所述膀胱癌EJ细胞标准品为膀胱癌EJ细胞的逐级稀释液。[4]根据[2]所述的试剂盒，其中，2)中所述的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 6906的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体BCMab2，其与磁颗粒通过共价键结合。[5]根据[2]所述的试剂盒，其中，2)中所述的磁颗粒是粒径为IOOnm至Ιμπι的氧化硅羟基磁颗粒。[6]根据[2]所述的试剂盒，其中，3)中所述的酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体是酶标记的BCMabl单克隆抗体,所述BCMabl单克隆抗体由保藏号为CGMCC No. 3845的杂交瘤细胞株制备(关于BCMabl单克隆抗体的制备具体可以参见中国专利申请号201010251384. 6)。[7]根据[2]所述的试剂盒，其中，3)中所述的酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶。[8]根据[2]所述的试剂盒，其中，5)中所述的反应管是具有光学透明度的聚苯乙烯管、聚乙烯管、聚丙烯管或者玻璃管；所述微孔板是适用于化学发光反应的检测的白色微孔板。本专利技术还提供制备所述试剂盒的方法方法，所述方法包括以下步骤I)配制膀胱癌EJ细胞标准品对膀胱癌EJ细胞溶液进行逐级稀释以制成膀胱癌EJ细胞的逐级稀释液；2)制备链酶亲合素修饰的磁颗粒；3)分别使用保藏号为CGMCC No. 3845和CGMCC No. 6906的两株单克隆杂交瘤细胞株制备可特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体BCMabl和BCMab2 ；4)制备生物素化的单克隆抗体BCMab2 :在微碱性条件下将生物素_N_羟基琥珀酰亚胺与所述抗体的游离赖氨酸发生偶联反应；5)使用2)中制备的链酶亲合素修饰的磁颗粒和4)中制备的生物素化的单克隆抗体BCMab2，通过链酶亲合素与生物素的特异性结合反应，制备由生物素化的单克隆抗体BCMab2包被的磁颗粒； 6)制备酶标记的单克隆抗体BCMabl :采用碳化二亚胺(EDC)偶联法，实现所述抗体上的氨基与所述酶分子上的羧基的结合；7)配制6)中的酶所作用的化学发光底物液；8)组装为成品。优选地，所述方法还包括以下步骤a)在所述由生物素化的单克隆抗体BCMab2包被的磁颗粒的制备后，用封闭液封闭所制备的由生物素化的单克隆抗体BCMab2包被的磁颗粒以降低非特异性吸附，所述封闭液包含O. 2% 1.0%牛血清白蛋白、O. 5% 1.0%酪蛋白、O. 5% 1.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测人膀胱癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括两种特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测人膀胱癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括两种特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒包括1)膀胱癌EJ细胞标准品；2)由特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体包被的磁颗粒；3)酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体；4)3)中的酶所作用的化学发光底物；5)反应管或微孔板，所述反应管或微孔板优选经过无蛋白封闭液的封闭处理，所述无蛋白封闭液为含有1. O %的鱼水解明胶，pH7. 2的O. 02M磷酸盐缓冲液；6)与5)中的反应管或微孔板配套的磁分离器。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述膀胱癌EJ细胞标准品为膀胱癌EJ细胞的逐级稀释液。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，2)中所述的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 6906的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体BCMab2，其与磁颗粒通过共价键结合。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，2)中所述的磁颗粒是粒径为IOOnm至Ιμπι的氧化硅羟基磁颗粒。6.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，3)中所述的酶标记的特异识别膀胱癌细胞表面抗原的单克隆抗体是酶标记的BCMabl单克隆抗体,所述BCMabl单克隆抗体由保藏号为 CGMCC No. 3845的杂交瘤细胞株制备。7.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，3)中所述的酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶。8.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，5)中所述的反应管是具有光学透明度的聚苯乙烯管、聚乙烯管、聚丙烯管或者玻璃管；所述微孔板是适用于化学发...
【专利技术属性】
技术研发人员：范祖森，张倩云，李翀，杜颖，王彦英，杨昭，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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