一种用于去除组织细胞的亲脂性去细胞溶液、试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及一种用于去除组织细胞的亲脂性去细胞溶液，其为CHAPS浓度为5‑50g/L、TnBP浓度为1‑5mM、ASB‑14浓度为5‑50g/L并且SB 3‑10浓度为5‑50g/L的20‑100mM的TRIS‑HCl缓冲液；还涉及一种用于去除组织细胞的试剂盒，其由A液和B液组成，所述A液为上述亲脂性去细胞溶液，B液为全能核酸酶溶液；还涉及一种用于去除组织细胞的去细胞方法，使用上述试剂盒处理所述组织。以上试剂和方法制备的异种组织去细胞生物支架去细胞完全，细胞外基质成分保留好，力学性能损伤小，免疫原性低，制备周期短、费用低，具有很好的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程材料领域，更特别地，涉及一种用于去除组织细胞的亲脂性去细胞溶液、试剂盒以及去细胞方法。
技术介绍
去细胞生物支架被广泛用于组织工程与再生医学中，目前应用于临床和临床前期研究的组织工程瓣膜支架材料亦主要为去细胞生物支架。然而免疫原性是阻碍异种去细胞生物支架应用于临床的最大障碍。CryoLife公司在临床上推出了两种去细胞瓣膜(SynerGraft)：CryoValve(同种异体去细胞主动脉瓣膜)和500/700(异种猪去细胞瓣膜)。CryoValve去细胞瓣膜自2000年已应用于超过5700例患者，近期临床结果较为满意。而同种异体主动脉瓣膜的最大不足是由于供体短缺而造成来源稀少。因此来源于猪或牛的异种组织因其来源广泛且与人体组织成分和性能相似，常用于去细胞瓣膜的构建。然而，异种猪瓣制备的500/700去细胞瓣膜用于4例患儿的右室流出道重建术，3例患儿均在术后一年内死亡，死因与强烈的免疫排斥反应导致瓣膜衰败相关。随后，异种组织来源的去细胞瓣膜在临床上的应用已寥寥无几。由此可见，异种组织的免疫原性是阻碍异种组织去细胞生物支架进一步应用于临床的关键难题。异种组织的免疫原性主要来源于细胞，因此去细胞可降低异种组织的免疫原性。目前去细胞基质的制备方法主要包括物理方法如压力法、冻融法，化学试剂如去污剂、有机溶剂，生物制剂如酶类等。多种去细胞方法均可完全地去除组织中的细胞成分，然而在这些方法处理的去细胞生物支架中仍可检测到异种抗原如α-Gal、MHCI，这些抗原的存在最终导致去细胞生物支架植入体内后发生免疫排斥反应和迅速衰败。单纯地去除组织的细胞成分难以最大限度地降低其免疫原性，这提醒我们需另辟蹊径。此外，目前应用的去细胞试剂和去细胞方法对瓣膜的结构和力学性能均造成不同程度的破坏，这些损伤可能会导致去细胞瓣膜植入体内后发生功能不全或迅速衰败。因此，需要一种新的去细胞生物支架的制备方法和试剂，其不仅能去除异种组织的免疫原性，而且能最大限度地保留细胞外基质成分与力学性能。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种用于去除组织细胞的亲脂性去细胞溶液，其为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-propanesulfonate,CHAPS)浓度为5-50g/L、磷酸三丁酯(tri(n-butyl)phosphate,TnBP)浓度为1-5mM、脒基磺基甜菜碱(amidosulfobetaine14,ASB-14)浓度为5-50g/L并且硫代甜菜碱10(sulfobetaine3-10,SB3-10)浓度为5-50g/L的20-100mM的TRIS-HCl缓冲液。优选地，所述CHAPS的浓度为20g/L，并且所述TnBP的浓度为2mM。优选地，所述ASB-14的浓度为10g/L，并且所述SB3-10的浓度为20g/L。优选地，所述TRIS-HCl的浓度为40mM，并且所述亲脂性去细胞溶液的pH值为7.8。本专利技术还提供了一种用于去除组织细胞的试剂盒，其由A液和B液组成，所述A液为上述亲脂性去细胞溶液，B液为全能核酸酶溶液。进一步地，所述全能核酸酶溶液的溶剂为pH值为8.0的50mMTris-HCl缓冲液，并且所述全能核酸酶的浓度为100unit/ml，所述全能核酸酶溶液中还包含1mM的MgCl2。本专利技术还提供了一种用于去除组织细胞的去细胞方法，其使用上述试剂盒处理所述组织，包括以下步骤：S1：用所述A液处理所述组织；S2：用PBS漂洗经S1处理的所述组织；S3：用所述B液处理经S2处理的所述组织；S4：用PBS漂洗经S3处理的所述组织，即得到去细胞的生物支架。优选地，所述方法包括以下步骤：S1：将所述组织浸没于所述A液中，于室温下持续振荡48小时，每24小时更换一次所述A液；S2：用PBS漂洗经S1处理的组织4次，每次6小时；S3：将经S2处理的组织浸没于所述B液中，于37℃下持续振荡24小时；S4：用PBS漂洗经S3处理的组织4次，每次6小时，即得到去细胞的生物支架。优选地，所述组织为猪主动脉瓣膜。本专利技术还提供了一种去细胞生物支架，其通过上述所述的方法得到。附图说明图1为天然瓣膜和去细胞瓣膜DAPI染色的显微照片；图2为是天然瓣膜和去细胞瓣膜组织学染色(HE、Masson、VVG染色)的显微照片(F:Fibrosa纤维层；S:Spongiosa疏松层；V:Ventricularis心室层，箭头指示弹性纤维)；图3为天然瓣膜和去细胞瓣膜的扫描电镜照片；图4为天然瓣膜和去细胞瓣膜的含水量统计图；图5为天然瓣膜和去细胞瓣膜的胶原蛋白含量统计图；图6为天然瓣膜和去细胞瓣膜的弹性蛋白含量统计图；图7为天然瓣膜和去细胞瓣膜的糖胺聚糖含量统计图；图8为去细胞瓣膜的大体形态以及力学性能检测时周向和径向样本制备示意图；图9为天然瓣膜和去细胞瓣膜的极限拉伸应变；图10为天然瓣膜和去细胞瓣膜的极限抗张强度；图11为天然瓣膜和去细胞瓣膜的弹性模量；图12为免疫荧光检测天然猪主动脉瓣膜和去细胞瓣膜上α-Gal表达的结果；图13为免疫荧光检测天然猪主动脉瓣膜和去细胞瓣膜上MHCI表达的结果；图14为天然猪主动脉瓣膜和去细胞瓣膜刺激PMN弹性蛋白酶的分泌水平；图15为天然猪主动脉瓣膜和去细胞瓣膜刺激SC5b-9的分泌水平。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1亲脂性去细胞溶液的制备亲脂性去细胞溶液的配制将精准称量的试剂加入干净的广口玻璃瓶中，摇床上振荡0.5～1h，使试剂充分溶解，制备成去细胞溶液(TnBP试剂因破坏性较强，最后加入，且现配现用)。SB3-10是一种两性离子型硫代甜菜碱，对溶解细胞膜蛋白具有超强的能力。ASB-14是一种两性离子型脒基磺基甜菜碱，它能促进多种脂溶性蛋白如红细胞带3蛋白的溶解。虽然SB3-10和ASB-14均属于具有长线性末端的甜菜碱类两性离子去污剂，但它们溶解蛋白的质量与类型各具特点。SB3-10倾向于溶解不同类别的酸性蛋白，而ASB-14对中性和碱性蛋白具有强烈的溶解作用，可用于去除异种组织中的脂溶性蛋白。实施例2使用实施例1的亲脂性去细胞溶液进行去细胞处理猪主动脉瓣膜的获取：在屠宰场清洁条件下获取猪心并置于含肝素的冷生理盐水中快速转运至实验室。在猪死亡的1h内，无菌条件下裁剪猪主动脉瓣膜，置于4℃含抗生素(100U/ml青霉素,250mg/ml两性霉素B和100mg/ml链霉素)的高糖DMEM培养基中12h。去细胞步骤：猪主动脉瓣膜的去细胞过程在六孔板中进行，每孔的工作容量为4ml且最多放置3片瓣膜。以亲脂性去细胞溶液进行去细胞处理：再将其置于含有20g/LCHAPS、2mmol/LTnBP、10g/LASB-14和20g/LSB3-10的TRIS-HCI缓冲液(40mmol/，pH7.8)中，在室温下震荡去细胞处理48h。每隔24h更换亲脂性去细胞溶液1次。以核酸酶继续处理：先将去细胞瓣膜以PBS漂洗4次，每次6h。然后置于含有1mmol/LMgCl2和100units/ml全能核酸酶的T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于去除组织细胞的亲脂性去细胞溶液，其特征在于，为包含CHAPS浓度为5‑50g/L、TnBP浓度为1‑5mM的、ASB‑14浓度为5‑50g/L并且SB 3‑10浓度为5‑50g/L的20‑100mM的TRIS‑HCl缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种用于去除组织细胞的亲脂性去细胞溶液，其特征在于，为包含CHAPS浓度为5-50g/L、TnBP浓度为1-5mM的、ASB-14浓度为5-50g/L并且SB3-10浓度为5-50g/L的20-100mM的TRIS-HCl缓冲液。2.如权利要求1所述的亲脂性去细胞溶液，其特征在于，所述CHAPS的浓度为20g/L，并且所述TnBP的浓度为2mM。3.如权利要求1所述的亲脂性去细胞溶液，其特征在于，所述ASB-14的浓度为10g/L，并且所述SB3-10的浓度为20g/L。4.如权利要求1-3中任一项所述的亲脂性去细胞溶液，其特征在于，所述TRIS-HCl的浓度为40mM，并且所述亲脂性去细胞溶液的pH值为7.8。5.一种用于去除组织细胞的试剂盒，其特征在于，由A液和B液组成，所述A液为如权利要求1-4中任一项所述的亲脂性去细胞溶液，B液为全能核酸酶溶液。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述全能核酸酶溶液的溶剂为pH值为8.0的50mMTris-HCl缓冲液，并且所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔韡华，董念国，史嘉玮，陈思，李庚，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42