miR‑1255在制备治疗膀胱癌药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种如下1)‑4)中任一所述物质在制备具有促进肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭的产品中的应用：1)miR‑1255；2)含有miR‑1255的编码基因的重组载体；3)含有miR‑1255的编码基因的重组病毒；4)含有miR‑1255的编码基因的重组病毒载体。本发明专利技术的实验证明，miR‑1255过表达后并未能影响SW780细胞的生长，但可显著增强膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力，在膀胱癌转移过程中可能起重要作用，因此说明，miR‑1255与膀胱癌转移相关。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体的，涉及一种microRNA在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。
技术介绍
microRNA(miR)，是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译，通常在转录后水平调控蛋白表达(最近发现microRNA也能在转录水平调控基因表达)。随着对microRNA研究的不断深入，越来越多的证据表明microRNA分子在肿瘤发生发展的各个环节中发挥着原癌基因或抑癌基因的作用。膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍。膀胱癌包括膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞状细胞癌、膀胱腺癌，其他罕见的还有膀胱透明细胞癌、膀胱小细胞癌、膀胱类癌。其中最常见的是膀胱尿路上皮癌，约占膀胱癌患者总数的90％以上。临床上，手术或放疗针对局限膀胱癌是有效的，并且针对转移性膀胱癌治疗仍然缺乏有效的药物。因此有必要寻找与膀胱癌发生、发展有关的miRNA，从而为临床上治疗转移性膀胱癌提供一种有效手段。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种如下1)-4)中任一所述物质在制备具有促进肿瘤功能的产品中的应用：1)miR-1255；2)含有miR-1255的编码基因的重组载体；3)含有miR-1255的编码基因的重组病毒；4)含有miR-1255的编码基因的重组病毒载体。所述促进肿瘤功能为促进肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭。所述肿瘤为膀胱癌。所述产品为药物；所述microRNA-145的核苷酸序列为序列表中的序列1。本专利技术的第二个目的是提供一种重组细胞。本专利技术提供的重组细胞，为将所述miR-1255、所述含有miR-1255的编码基因的重组载体、所述含有miR-1255的编码基因的重组病毒或含有miR-1255的编码基因的重组病毒载体导入出发细胞中得到的重组细胞。所述出发细胞为肿瘤细胞；所述肿瘤细胞具体为膀胱癌细胞。所述的重组细胞在筛选和/或制备抑制肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭药物中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的第三个目的是提供一种具有促进肿瘤功能的产品。本专利技术提供的产品，其活性成分为所述miR-1255、所述含有miR-1255的编码基因的重组载体、所述含有miR-1255的编码基因的重组病毒或含有microRNA-145的编码基因的重组病毒载体。所述促进肿瘤为促进肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭。所述肿瘤为膀胱癌；所述产品为药物。抑制miR-1255活性或者表达的物质在制备具有抑制肿瘤功能的产品中的应用也是本专利技术保护的范围。所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭，所述肿瘤具体为膀胱癌。本专利技术的实验证明，miR-1255过表达后并未能影响SW780细胞的生长，但可显著增强高转移性膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力，在膀胱癌转移过程中可能起重要作用，因此说明，miR-1255与膀胱癌转移相关。附图说明图1为荧光显微镜下观察慢病毒载体介导GFP-miR-1255在SW780细胞中的表达情况和RT-PCR检测细胞中miR-1255的相对含量；图2为利用CCK-8绘制SW780-miR-1255，SW780-nc的生长曲线；图3为miR-1255对SW780细胞迁移能力的影响；图4为miR-1255对SW780细胞侵袭能力的影响。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、稳定高表达miR-1255的转移性膀胱癌细胞系的获得一、膀胱癌细胞系的获得大肠癌细胞系SW780(ATCC)，其培养基为含有10％的胎牛血清(Hyclone)和浓度为0.2％的青链霉素(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen，31053036)。A、细胞复苏(1)取出SW780(ATCC)的冻存管，立即放入37℃-40℃水浴中，快速摇晃直至完全融化。(2)将细胞悬液转入10ml冷PBS中，放入15ml离心管中，用水平离心机离心细胞(1000转/分钟，8分钟)后弃上清。(3)用适量新鲜培养基悬浮细胞，将细胞悬液转入培养瓶中，置37℃二氧化碳培养箱中培养。B、细胞培养将膀胱癌细胞系放入培养基中，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，根据细胞生长情况，每天或者隔天更换新鲜培养基，细胞浓度约为培养瓶培养面积80％-90％时进行传代。C、细胞冻存(1)选取处于指数生长期的细胞，冻存前1天给细胞换液1次。(2)贴壁细胞以常规方法消化，制备成单细胞悬液。收集悬液，离心(1000转/分钟，5分钟)。(3)弃上清，用冻存管重悬细胞，调整细胞浓度至5×106/mL。(4)将细胞悬液移入冻存管，扭紧管盖，注明细胞名称和冻存日期，放入冻存盒，置于-80℃冰箱24小时后，移至液氮中保存。D、细胞传代(1)倒掉培养瓶中的培养基，加入37℃PBS轻轻洗涤细胞，吸出PBS，加入胰蛋白酶(25cm2培养瓶加500微升胰酶，75cm2和10cm直径培养皿加入1毫升胰酶)，在显微镜下观察消化过程，待细胞变圆、细胞间连接断开。(2)加入十倍于胰酶体积的PBS，用一次性吸管将细胞轻轻吹打，成细胞悬液。(3)收集悬液于15或者50mL离心管中，离心(1000转/分钟，5分钟)。(4)用新鲜培养基重悬细胞，按1∶2移入新的培养平或培养皿，得到传代后SW780细胞。二、细胞转染1、转染GFP-miR-1255慢病毒表达系统(其中外源基因为miR-1255，Genebank号为NR_031656.1，即为序列1，购自上海吉凯基因化学技术有限公司，为能表达microRNA1255的慢病毒颗粒)，根据该公司的操作指南进行细胞转染：1)、分别将生长良好的步骤一得到的传代后SW780细胞于转染前一天接种到96孔板中(正常培养，37℃，5％CO2培养箱)，转染时细胞密度达到30％。2)、每孔中弃去原培养液，加入100μL培养基及1μL慢病毒试剂(GFP-miR-1255慢病毒表达系统)，温和混匀。3)、37℃培养24小时后，换正常培养基终止转染。4)、然后37℃培养72小时后，得到SW780-high细胞系。采用同样的方法将NC慢病毒表达系统(购自上海上海吉凯基因化学技术有限公司，其与GFP-miR-1255慢病毒表达系统相比没有外源基因miR-1255)转染SW780细胞，得到SW780-NC。2、检测细胞中miR-1255的表达1)、荧光显微镜观察将上述获得的SW780-high细胞系和SW780-NC分别置于荧光倒置显微镜下，检测其表达miR-1255情况，结果如图1中A和B所示，miR-1255为SW780-high细胞系，NC为SW780-NC，从图中可以看出，SW780-high细胞系稳定高表达miR-1255(有荧光反应)。荧光显微镜下观察本文档来自技高网...

【技术保护点】
如下1)‑4)中任一所述物质在制备具有促进肿瘤功能的产品中的应用：1)miR‑1255；2)含有miR‑1255的编码基因的重组载体；3)含有miR‑1255的编码基因的重组病毒；4)含有miR‑1255的编码基因的重组病毒载体；所述促进肿瘤功能为促进肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭；所述肿瘤为膀胱癌；所述产品为药物；所述miR‑1255的核苷酸序列为序列表中的序列1。

【技术特征摘要】
1.如下1)-4)中任一所述物质在制备具有促进肿瘤功能的产品中的应用：1)miR-1255；2)含有miR-1255的编码基因的重组载体；3)含有miR-1255的编码基因的重组病毒；4)含有miR-1255的编码基因的重组病毒载体；所述促进肿瘤功能为促进肿瘤细胞的迁移、扩散和/或侵袭；所述肿瘤为膀胱癌；所述产品为药物；所述miR-1255的核苷酸序列为序列表中的序列1。2.一种重组细胞，为将所述miR-1255、所述含有miR-1255的编码基因的重组载体、所述含有miR-1255的编码基因的重组病毒或含有miR-125...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔健，姜薇，
申请(专利权)人：北京信生元生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11