一种抑制肿瘤生长和转移的miRNA序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抑制肿瘤生长的miRNA序列及其应用。本发明专利技术所提供的核酸序列为如下(A)或(B)：(A)双链RNA：所述双链RNA由正义链(序列1)和反义链(序列2)组成；(B)由一条单链RNA(序列1)和一条单链DNA(将序列2中的U替换为T后所示序列)互补配对形成的嵌合双链。本发明专利技术所提供的核酸序列在动物水平能在体内有效抑制肿瘤的生长；在细胞水平能够抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞侵袭、抑制肿瘤细胞迁移和促进肿瘤细胞凋亡。因此，本发明专利技术所提供的核酸序列作为一种新型小核酸类的抗肿瘤药物，既能抑制体内肿瘤的生长，降低肿瘤扩散风险，也有望用于预防肿瘤切除或放疗、化疗后的残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，涉及一种抑制肿瘤生长和转移的miRNA序列及其应用。
技术介绍
microRNA是一类由内源基因编码的长度约为19-25个核苷酸的非编码单链RNA分子。其在不同的物种间具有很高的同源性，可能调控着人类基因的1/3。microRNAs参与调控个体发育，细胞的增殖分化、周期等活动主要有三种方式：成熟的microRNA互补结合mRNA，RISC特异降解靶mRNA抑制mRNA的翻译；成熟microRNA在不影响mRNA稳定的前提下，与靶mRNA的3′UTR，抑制靶mRNA的表达；microRNA与剪切目标mRNA聚腺苷酸末端配对结合后，靶mRNA被3′核酸外切酶水解，在转录后水平对靶mRNA进行负性调控。通过靶向不同的基因，microRNA实现其肿瘤细胞的功能调控。研究表明，越来越多的原癌或抑癌基因在肿瘤细胞与正常组织间的表达存在显著差异，且与肿瘤的发生、发展存在关联性。运用microRNA的原癌或抑癌基因的功能，利用相关技术，或可实现肿瘤精准治疗的可能。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种核酸序列。本专利技术所提供的核酸序列，为如下(A)或(B)：(A)双链RNA：所述双链RNA由正义链和反义链组成，所述正义链具有序列表中序列1所示序列，所述反义链具有序列表中序列2所示序列；(B)由一条单链RNA和一条单链DNA互补配对形成的嵌合双链：所述嵌合双链中的所述单链RNA具有序列表中序列1所示序列，所述单链DNA具有将序列表中序列2中的U替换为T后所示序列。在本专利技术中，所述(A)中，所述正义链的序列具体为序列表中序列1，所述反义链具体为序列表中序列2。所述(B)中，所述单链RNA的序列具体为序列表中序列1，所述单链DNA的序列具体为将序列表中序列2中的U替换为T后所示序列。根据需要所述核酸序列可经过如下修饰中的至少一种：(1)对所述核酸序列的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰(如磷酸二酯键中的氧被硫取代)；(2)对所述核酸序列的核苷酸序列中的核糖的2′-OH的修饰(如2′-OH经过甲氧基取代、氟取代或者脱氧修饰)；(3)对所述核酸序列的核苷酸序列中的碱基的修饰(如LNA等修饰；胆固醇、甲氧基、硫代、氨基等修饰；3′或5′的特殊修饰，包括生物素、荧光基团及其它特殊标记)。进一步，所述核酸序列为化学合成，可以进行2′氟代(2′-F)、2′甲氧基(2′-OMe)、硫代(PS)和2′脱氧(2′-deoxy)化学修饰。修饰的核酸序列分子可分别表示如下：所述核酸序列-2′-F、所述核酸序列-PS、所述核酸序列-2′-OMe和所述核酸序列-2′-deoxy。或是核苷酸序列的5'p、5'巯基、5'NH2、5'Chol、5-Me-dC修饰、5'TET、5'Biotin3'NH2、3'Chol、3'BHQ-1、3'Dabcyl，或是C6S-S修饰等修饰。所述核酸序列分子有作用的重要肿瘤调控基因例如转录因子Jun等，但不仅限于该靶基因。进一步，含有所述DNA分子的重组载体或重组菌也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第二个目的是提供一种应用。本专利技术所提供的应用，具体为：所述核酸序列或所述DNA分子或所述重组载体或重组菌在如下任一中的应用：(a1)制备用于抑制肿瘤生长的药物，和/或抑制肿瘤生长；(a2)制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物，和/或抑制肿瘤细胞增殖；(a3)制备用于抑制肿瘤细胞侵袭的药物，和/或抑制肿瘤细胞侵袭；(a4)制备用于抑制肿瘤细胞迁移的药物，和/或抑制肿瘤细胞迁移；(a5)制备用于促进肿瘤细胞凋亡的药物，和/或促进肿瘤细胞凋亡；(a6)制备用于预防肿瘤复发的药物，和/或预防肿瘤复发。其中，所述预防肿瘤复发具体为预防肿瘤摘除术或放化疗后残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发。本专利技术的第三个目的是提供一种药物。本专利技术所提供的药物具有如下(a1)-(a6)功能中至少一种，其活性成分为所述核酸序列或所述DNA分子或所述表达盒、重组载体或重组菌；(a1)抑制肿瘤生长；(a2)抑制肿瘤细胞增殖；(a3)抑制肿瘤细胞侵袭；(a4)抑制肿瘤细胞迁移；(a5)促进肿瘤细胞凋亡；(a6)预防肿瘤复发。根据需要，所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体应当与本专利技术药物中的双链RNA分子相容。进一步，所述药学上可接受的载体可为体内转染试剂，如脂质体，聚乙烯亚胺(PEI)、阳离子纳米聚合物等。或是传统的药物载体，糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、植物油等渗缓冲液等。或者是新型药物载体制剂：大分子物质，如免疫球蛋白、白蛋白、纤维原、葡萄糖等；经过或未经过改造的细胞，如白细胞、红细胞等；合成得到的生物可降解性大分子脂质体，如静脉乳、磁性球剂、玉脂聚糖球等；合成的非生物降解性大分子，如半渗透微囊、聚丙烯凝胶等。本专利技术的药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者种类、发病情况、给药方式等因素中和考虑对病人进行有益的剂量施用。具体剂型可包括口服液、注射剂、舌下含服剂等多种液体剂型，或通过加以适当的赋形剂制备成粉剂、片剂、胶囊剂等多种其他剂型。较佳的制剂为保持核酸序列的效能、毒副作用低、给药途径适宜。在本专利技术的实施例中，所述药学上可接受的载体具体为脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen)。相应的，所述药物中，所述核酸序列和所述Lipofectamine2000的配比具体为(5-50)pmol：1μL，如(20-32)pmol：1μL，具体如20pmol：1μL，或者30pmol：1μL，或者50pmol：1μL。更加具体的，所述药物中，所述核酸序列溶液的浓度为20μmol/L，所述核酸序列溶液和所述Lipofectamine2000的体积配比具体为(1-1.6)：1，如1：1，或者1.5：1，或者1.6：1。所述药物中还可以包括葡萄糖、生理盐水或者缓冲液等。在本专利技术中，所述肿瘤具体为肝癌；所述肿瘤细胞具体为肝癌细胞。更加具体的，所述肝癌细胞为HepG2细胞或SK-HEP-1细胞。实验证明，本专利技术所提供的核酸序列通过抑制肝癌肿瘤细胞内核转录因子Jun的表达，实现抑制肿瘤生长的作用。在动物水平，将肿瘤细胞接种裸鼠，随后用所述核酸序列治疗的实验证明所述核酸序列能在体内有效抑制肿瘤的生长。另外，在细胞水平，还证实了本专利技术所提供的核酸序列具有抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞侵袭、抑制肿瘤细胞迁移和促进肿瘤细胞凋亡的作用。因此，本专利技术所提供的核酸序列作为一种新型小核酸类的抗肿瘤药物，既能抑制体内肿瘤的生长，降低肿瘤扩散风险，也有望用于预防肿瘤切除或放疗、化疗后的残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发。附图说明图1为CCK-8方法检测实施例1制备的2′-OH核酸序列抑制肿瘤细胞增殖的折线图；图2为实施例1制备的2′-OH核酸序列抑制肿瘤细胞侵袭的柱形图；图3为实施例1制备的2′-OH核酸序列抑制肿瘤细胞迁移的柱形图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所涉及的定量实验，均设置至少3个重复，结果取均值。5周龄的雄性裸鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司(BALB/cNude401)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸序列，为如下(A)或(B)：(A)双链RNA：所述双链RNA由正义链和反义链组成，所述正义链具有序列表中序列1所示序列，所述反义链具有序列表中序列2所示序列；(B)由一条单链RNA和一条单链DNA互补配对形成的嵌合双链：所述嵌合双链中的所述单链RNA具有序列表中序列1所示序列，所述单链DNA具有将序列表中序列2中的U替换为T后所示序列。

【技术特征摘要】
1.一种核酸序列，为如下(A)或(B)：(A)双链RNA：所述双链RNA由正义链和反义链组成，所述正义链具有序列表中序列1所示序列，所述反义链具有序列表中序列2所示序列；(B)由一条单链RNA和一条单链DNA互补配对形成的嵌合双链：所述嵌合双链中的所述单链RNA具有序列表中序列1所示序列，所述单链DNA具有将序列表中序列2中的U替换为T后所示序列。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于：所述(A)中，所述正义链的序列为序列表中序列1，所述反义链为序列表中序列2；所述(B)中，所述单链RNA的序列为序列表中序列1，所述单链DNA的序列为将序列表中序列2中的U替换为T后所形成的序列。3.根据权利要求1或2所述的核酸序列，其特征在于：所述核酸序列经过如下修饰中的至少一种：(1)对所述核酸序列的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述核酸序列的核苷酸序列中的核糖的2′-OH的修饰；(3)对所述核酸序列的核苷酸序列中的碱基的修饰。4.编码权利要求1或2所述核酸序列的DNA分子。5.含有权利要求4所述DNA分子的重组载体或重组菌。6.权利要求1-3中任一所述的核酸序列或权利要求4所述的DNA分子或权利要求5所述的重组载体或重组菌在如下任一中的应用：(a1...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜薇，崔健，
申请(专利权)人：北京信生元生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11