gma-miR1508a及其应用制造技术

本发明专利技术公开了gma-miR1508a及其应用。本发明专利技术提供了一种miRNA，命名为gma-miR1508a，如序列表的序列1所示。本发明专利技术还提供了gma-miR1508a的前体，命名为pre-gma-miR1508a，如序列表的序列2所示。本发明专利技术还保护编码gma-miR1508a的DNA分子(命名为DNA分子甲)和编码pre-gma-miR1508a的DNA分子(命名为DNA分子乙)。本发明专利技术还保护一种培育转基因植物的方法，是将含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的DNA分子导入目的植物，得到对低温的耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。本发明专利技术对于培育耐冷植物，从而提高植物的产量具有重要的价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种应答冷胁迫的miRNA(gma-miR1508a)及其前体，以及它们的应用。
技术介绍
萌发期遇到低温会降低大豆的萌发率，延迟萌发和出苗，影响幼苗的整齐度，从而对产量的形成产生不利影响。大量研究表明，植物受低温等逆境胁迫时，细胞内氧代谢平衡失调，产生活性氧，引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统损伤。大豆耐冷育种已成为东北冷害频繁农作区的育种目标，然而由于大豆对环境条件反应敏感，生理代谢作用复杂，有关耐冷分子机理理论研究还相当少。miRNA(microRNA，微小RNA)是一类长度约为20-24个核苷酸的内源单链非编码小分子RNA，可通过调控细胞中与某信号转导途径相关mRNA，指导靶基因的切割或降低靶基因的翻译，在转录后水平抑制植物基因表达，从而影响植物形态发生、发育过程、适应环境的能力和激素信号传导等，是一种新的基因调控模式。近年来大量研究表明，miRNA参与调控植物生长发育以及应答生物和非生物胁迫等许多重要生物学过程。因此，有理由相信miRNA在植物应答冷害过程中起着作用。但是，目前的植物应答冷胁迫相关研究主要集中在基因和蛋白，还很少涉及到植物小分子RNA、特别是miRNA领域。植物中是否存在着应答冷胁迫的miRNA，这些miRNA的作用是什么，目前还没有明确的答案。寻找和鉴定植物体内应答冷胁迫的miRNA，对于完善植物冷胁迫相关的调控网络，全面解析植物应答冷胁迫的分子机制具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供gma-miR1508a及其应用。本专利技术提供了一种miRNA，来源于大豆，命名为gma-miR1508a，如序列表的序列1所示。本专利技术还提供了gma-miR1508a的前体，命名为pre-gma-miR1508a，如序列表的序列2所示。本专利技术还保护编码gma-miR1508a的DNA分子(命名为DNA分子甲)，如序列表的序列3所示。本专利技术还保护编码pre-gma-miR1508a的DNA分子(命名为DNA分子乙)，如序列表的序列4所示。含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体可为重组质粒p3300-miR1508。重组质粒p3300-miR1508的制备方法如下：用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切重组质粒p121-1508a，回收小片段(35S-pre-gma-miR1508a的编码DNA-NOS)；用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切pCAMBIA3300载体，回收载体骨架；将所述小片段和所述载体骨架连接，得到重组质粒p3300-miR1508。所述重组质粒p121-1508a为在pBI121载体的多克隆位点插入序列表的序列4所示的DNA分子得到的重组质粒。所述重组质粒p121-1508a具体可为将pBI121载体XbaI和SacI酶切位点之间的小片段(GUS基因)取代为序列表的序列4所示的DNA分子得到的重组质粒。本专利技术还保护一种培育转基因植物的方法，是将含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的DNA分子导入目的植物，得到对低温的耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。所述含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的DNA分子具体可为含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的表达盒。所述含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的DNA分子具体可为重组质粒p3300-miR1508。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆，例如大豆品种“东农50”。所述低温具体可为4℃、6±1℃或0℃±1℃。本专利技术还保护一种培育转基因植物的方法，是将含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的DNA分子导入目的植物，得到株高低于所述目的植物的转基因植物。所述含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的DNA分子具体可为含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的表达盒。所述含有所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的DNA分子具体可为重组质粒p3300-miR1508。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆，例如大豆品种“东农50”。本专利技术还保护gma-miR1508a在抑制PPR基因表达中的应用。所述PPR基因为编码序列表的序列5所示的蛋白质的基因。所述PPR基因具体可如序列表的序列6所示。本专利技术还保护gma-miR1508a或pre-gma-miR1508a在大豆种质改良中的应用。本专利技术还保护gma-miR1508a或pre-gma-miR1508a在培育耐低温大豆中的应用。所述低温具体可为4℃、6±1℃或0℃±1℃。本专利技术对于培育耐冷植物，从而提高植物的产量具有重要的价值。附图说明图1为gma-miR1508a受冷诱导表达的验证。图2为重组质粒p3300-miR1508的结构示意图。图3为转基因大豆苗期抗冷试验的结果。图4为转基因植株考种的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。大豆品种“中品95-5383”：中国农业科学院作物科学研究所育成；郑翠明，常汝镇，邱丽娟.大豆对SMV3号株系的抗性遗传分析.中国农业科学8001，34(1)：14—18。大豆品种“东农50”：东北农业大学大豆研究所育成；黑审豆2007022。pCAMBIA3300载体：CAMBIA；参考文献：文献Ashraf Abdeen and Brian Miki.(2009)The pleiotropic effects of the Bar gene and glufosinate on the Arabidopsis Transcriptome.Plant Biotechnology Journal,7,266-282。pBI121载体：Clontech(Cat:6018-1)。农杆菌菌株LBA4404：Takara公司(Agrobacterium tumefaciens Electro-Cells LBA4404,Code：D9115)。B5培养基成分见表1。MS培养基成分见表2。表1 B5培养基成分表2 MS培养基成分实施例1、gma-miR1508a的发现一、处理1、取大豆品种“中品95-5383”种子，用8g/100ml次氯酸钠水溶液、70％(体积比)酒精水溶液各处理4min，然后用无菌水反复冲洗3次，然后在人工气候箱中培养3周(培养条件：温度为25℃，光强为10000lux，光周期为16h光照/8h黑暗，湿度为65％)。2、完成步骤1后，选长势一致的苗，轻柔的将根洗净，移入1/2Hoagland营养液中稳定培养3天(每天更换营养液，其它培养条件同步骤1)后进行各种胁迫处理。干旱胁迫处理：将幼苗用滤纸吸干根部水份，并用滤纸包裹置于锥形瓶内培养；盐胁迫处理：将幼苗移入含300mM NaCl的1/2Hoagland营养液中培养；低温胁迫处理：将幼苗移入1/2Hoagland营养液中4℃培养；脱落酸(ABA)处理：将幼苗移入含50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种miRNA，如序列表的序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA，如序列表的序列1所示。2.序列表的序列2所示的RNA。3.编码权利要求1所述miRNA的DNA分子。4.编码权利要求2所述RNA的DNA分子。5.含有权利要求3或4所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。6.一种培育转基因植物的方法，是将含有权利要求3或4所述DNA分子的DNA分子导入目的植物，得到对低温的耐逆性高于所述目...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱丽娟，李文滨，金龙国，罗中钦，李永光，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，东北农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11