本发明专利技术公开了获取miRNA的候选靶基因的方法及其专用反转录引物。该方法包括：1）以带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，获取与目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；2）以带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，获取真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14-20；3）将所述A库和所述B库合成双链cDNA后进行杂交得到杂交DNA分子，扩增所述杂交DNA分子上所述目的miRNA种子序列和所述特异接头之间的DNA片段，根据所述扩增产物得到目的miRNA的候选靶基因。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及获取miRNA候选靶基因的方法及其专用反转录弓I物。
技术介绍
微小RNA (microRNA, miRNA)是一类小分子非编码RNA，约为22碱基大小。其通过结合靶基因的3’非翻译区(3’ UTR)造成靶基因mRNA的降解或靶蛋白翻译的抑制。研究表明miRNA的生物功能是通过调控靶基因而实现的，miRNA通过作用于相应靶mRNA，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。控制着包括动、植物器官形成、发育、代谢以及某些疾病的发生。miRNA以不完全配对方式与靶基因相结合，这种不完全配对模式使得miRNA及其靶基因的调控网络非常复杂，即一条miRNA可以同时作用若干甚至上百个功能基因，一个功能基因也可能受高达数十条miRNA所调控。很难通过分子生物学实验加以一一验证。Bartel 等(Friedman, R.C., K.K.Farh, C.B.Burge, and D.P.Bartel.2009.Most mammalianmRNAs are conserved targets of microRNAs.Genome Resl9:92-105)研究发现 miRNA 的5’端第2-8个碱基的种子序列与靶基因序列精确配对，基于这一结合特性相续开发出了一系列miRNA靶基因生物信息学预测软件。寻找miRNA 的靶基因的方法主要分为生物信息学方法和生物学实验方法。生物学实验方法获得数据较为准确，其缺点是一次只能证明一条靶基因，通量不够。生物信息方法获得数据通量较大，但准确率较低。两种方法各有特点但都必须有一个硬性前提，即所分析物种的基因组信息需较为完整。绵羊基因组虽已发布第二版(V2.0)，第四版至今没有公布，参见官方测序网站(http://www.animalgenome.0rg/sheep/),由于版本较低,测序质量不高，存在很多没有测通的片段(gap)，基因组数据不够完整，大量基因的3’UTR序列未知。因此利用以上两种方法很难批量获得绵羊骨骼肌miRNA及其靶基因调控网络的完整信息。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种获取miRNA候选靶基因的方法、获取miRNA与mRNA的候选结合位点的方法及其专用反转录引物。本专利技术所提供的获取miRNA候选靶基因的方法，包括:I)以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链,得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件:所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57-62%，环部不配对碱基数< 6个，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA,所述miR-X的5'至3'方向是Y至Y方向单链DNA序列的反向序列:所述:V至Y方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3'至5'方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；2)以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链,得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14_2(l,所述特异接头满足如下条件:所述特异接头的CG含量为50% 60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数< 5个，最大串联配对碱基数目小于< 4个；3)合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为Ai库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B'库；将所述A'库和所述B'库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物Al和引物BI扩增所述杂交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA的候选靶基因；所述引物Al是选自所述反转录引物A的单链DNA，所述引物Al的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物BI的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。本专利技术所提供的获取miRNA与mRNA的候选结合位点(候选结合区)的方法，包括:I)以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链,得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构-miR-X，所述茎环结构满足如下条件:所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57-62%，环部不配对碱基数< 6个，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA,所述miR-X的5'至3'方向是Y至Y方向单链DNA序列的反向序列:所述:V至Y方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3'至5'方 向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；2)以名称为反转录引物B的带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链,得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14_2(l,所述特异接头满足如下条件:所述特异接头的CG含量为50% 60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数< 5个，最大串联配对碱基数目小于< 4个；3)合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A'库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B'库；将所述A'库和所述B'库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物Al和引物BI扩增所述杂交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA与mRNA的候选结合位点；所述引物Al是选自所述反转录引物A的单链DNA,所述引物Al的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物BI的序列是所述反转录引物B的部分本文档来自技高网...
【技术保护点】
获取miRNA候选靶基因的方法，包括：1）以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构?miR?X，所述茎环结构满足如下条件：所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57%?62%，环部不配对碱基数≤6个，且能值低于?30.00kcal/mol；所述miR?X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA，所述miR?X的5′至3′方向是3′至5′方向单链DNA序列的反向序列：所述3′至5′方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3′至5′方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；2）以名称为反转录引物B的带特异接头和14?20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头?T14?20，所述特异接头满足如下条件：所述特异接头的CG含量为50%～60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数≤5个，最大串联配对碱基数目小于≤4个；3）合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A′库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B′库；将所述A′库和所述B′库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物A1和引物B1扩增所述杂交DNA分子上所述引物A1和所述引物B1之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA的候选靶基因；所述引物A1是选自所述反转录引物A的单链DNA，所述引物A1的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物B1的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：甘尚权，高蕊，王立民，沈敏，王新华，刘守仁，
申请(专利权)人：新疆农垦科学院，
类型：发明
国别省市：
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