核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法及miRNA检测方法技术

本发明专利技术提供一种具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列、具有SEQ ID NO:2的通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法以及miRNA检测方法。在miRNA检测方法中，使用所述通用反转录引物对miRNA样品进行cDNA合成，而所述通用反向引物用于在qPCR定量检测时进行所述cDNA分子扩增。所述引物设计方法使用所述通用反向引物序列、所述核苷酸序列及设计规则，以设计qPCR定量检测所用的引物。本发明专利技术的通用反转录引物、通用反向引物以及由引物设计方法所设计出的引物具有较佳的特异性及敏感度，同时兼具降低成本及方便使用的特性，且不需对引物进行额外修饰。

Nucleotide sequence, universal reverse primer, universal reverse transcription primer, primer design method and miRNA detection method

The invention provides an SEQ ID NO:1 nucleotide sequence, with SEQ ID NO:2 universal reverse primer, universal reverse transcription primer, primer design method and miRNA detection method. In the miRNA detection method, the miRNA sample is synthesized by using the universal reverse transcription primer, and the universal reverse primer is used to amplify the cDNA molecule in the quantitative detection of qPCR cDNA. The primer design method uses the universal reverse primer sequence, the nucleotide sequence and the design rule to design the primers used for quantitative detection of qPCR. General transcription primer of the invention, a universal reverse primer and a primer design method to design the primers with good specificity and sensitivity, both reduce the cost and characteristics of convenient use, without additional modification of primers.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是有关于一种核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法及miRNA检测方法，且特别是有关于一种应用于miRNA检测、定量和表达谱分析的核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法及miRNA检测方法。
技术介绍
miRNA为高度保守的非编码RNA，长度约为18-25个核苷酸，其能够调控生物体的基因表现。近年来，研究结果显示miRNA与许多疾病相关，特别是癌症，miRNA具有致癌基因或抑癌基因的作用，在人类癌症的病理生理学中扮演重要角色。更详细而言，miRNA在癌症病例中的表现情形，可作为癌症诊断和预后判断的工具，甚至能够进一步预测病患的存活率，已成为新一代的癌症生物标记(Biomarker)。此外，也基于健康个体与癌症病患之间的miRNA表现差异，发展出各种癌症诊断工具。因此，用于miRNA检测、定量和表达谱分析(expression profiling)的材料和方法是重要且关键的。在现有技术中，检测与定量miRNA的方法包括北方墨点杂交法(Northern blot hybridization)、转殖技术(cloning)、微阵列基因芯片分析及次世代定序技术。相较于现有技术，即时定量反转录聚合酶链锁反应(qRT-PCR，quantitative real-time reverse transcription PCR)方法具有较高的敏感度及特异性。目前已发展出各种不同的qRT-PCR方法，这些方法主要可分成以下两种。第一种方法是使用茎环反转录引物(stem-loop RT primer)进行cDNA合成，并使用miRNA特异性探针(miRNA specific probe)或通用探针(universal probe)对miRNA进行定量。第二种方法则是使用线性的通用反转录引物(universal RT primer)进行cDNA合成，并使用miRNA特异性正向引物(miRNA specific forward primer)、反转录引物特异性反向引物(RT-primer specific reverse primer)以及双股DNA结合染料(double-stranded DNA intercalating dye)进行miRNA的定量。针对上述qRT-PCR方法，第一种方法的反转录引物因含有一个茎环结构，具有较佳的特异性，但所使用的miRNA特异性探针或通用探针的成本较高。第二种方法不需使用探针，因此，可进一步降低成本。然而，第二种方法所使用的线性通用反转录引物的特异性较第一类的茎环反转录引物差，且目前市售的通用反转录引物可能需要进一步修饰。基于上述，如何提升线性通用反转录引物及反向引物的特异性及敏感度，同时兼具降低成本及方便使用的特性，以检测、定量和分析miRNA的表现量，为目前所需改良的重要课题。
技术实现思路
本专利技术提供一种核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物及引物设计方法，适用于miRNA检测、定量和表达谱分析的qRT-PCR方法，其中通用反向引物、通用反转录引物以及由引物设计方法所设计出的引物具有较佳的特异性及敏感度，同时兼具降低成本及方便使用的特性，且不需对引物进行额外的核酸修饰(oligonucleotide modification)。本专利技术提供一种具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，用于设计miRNA qPCR检测所用的正向引物，与反向引物搭配以进行cDNA分子扩增。本专利技术提供一种具有SEQ ID NO:2的通用反向引物，用于miRNA qPCR检测中与正向引物搭配进行cDNA分子扩增。在本专利技术的一实施例中，通用反向引物的Tm值为59.1℃。本专利技术提供一种通用反转录引物，用于对待测miRNA样品进行cDNA合成，通用反转录引物为以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN其中R为5’端的核苷酸序列且为SEQ ID NO:2，(dT)n为中间部分n个连续的胸腺嘧啶残基(thymine residue)，n为19，VN为3’端由核苷酸残基组成的序列，V为腺嘌呤残基(adenine residue)、鸟粪嘌呤残基(guanine residue)或胞嘧啶残基(cytosine residue)，N为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。本专利技术提供一种引物设计方法，所述引物用于miRNA qPCR检测，包括以下步骤。确认待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度。当待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度低于90％时，以第一设计方法设计正向引物，第一设计方法包括第一调整步骤以及第一确认步骤。在第一调整步骤中，使正向引物与具有SEQ ID NO:2的通用反向引物之间的Tm值差异不超过2度，当正向引物的Tm值低于57℃时，在5’端依序地增加具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，以使正向引物的Tm值达到57℃至61℃。在第一确认步骤中，确认正向引物的二聚体(dimer)的△G大于-7.5千卡/摩尔。当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，删减二聚体区域的正向引物序列，以避开形成二聚体的区域，并重新进行第一调整步骤及第一确认步骤。当待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度高于90％时，以第二设计方法设计正向引物及反向引物，第二设计方法包括重叠设计步骤、第二调整步骤以及第二确认步骤。在重叠设计步骤中，比对待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的核苷酸差异位置，并使正向引物及反向引物的3’端的最后一个核苷酸残基设计至所述核苷酸相异位置上，若仍无法区分待测miRNA与同物种中的其他miRNA，将正向引物或反向引物再往前增加一个重叠的碱基，或将正向引物和反向引物同时再增加一个重叠碱基。在第二调整步骤中，使正向引物与反向引物之间的Tm值差异不超过2度，且当正向引物的Tm值低于55℃时，在5’端依序地增加具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，当反向引物的Tm值低于55℃时，在5’端依序地增加具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，以使正向引物与反向引物的Tm值达到55℃至61℃。在第二确认步骤中，确认正向引物及反向引物的二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔。当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，更换增加于正向引物5’端的具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，其中具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有不同的核苷酸残基组合，以避开形成二聚体的区域，并重新进行第二调整步骤及第二确认步骤。当第二设计方法无法避开形成二聚体的区域时，若二聚体问题是由反向引物造成，进行第三设计方法，若二聚体问题是由正向引物造成，进行第四设计方法。第三设计方法包括延长正向引物的3’端长度并缩短反向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中核苷酸差异位置设计在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内，且在缩短反向引物的3’端长度后若Tm值不足，则在反向引物的5’端依序地增加具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。第四设计方法包括延长反向引物的3’端长度并缩短正向引物的3’端长度，以避开形成二聚体的区域，其中核苷酸差异位置设计在正向引物或反向引物的3’端的最后四个核苷酸内，在缩短正向引物的3’端长度后若T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，用于设计miRNA qPCR检测所用的正向引物。

【技术特征摘要】
2015.06.02 US 62/169,5631.一种具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，用于设计miRNA qPCR检测所用的正向引物。2.一种具有SEQ ID NO:2的通用反向引物，用于在miRNA qPCR检测中进行cDNA分子扩增。3.根据权利要求2所述的具有SEQ ID NO:2的通用反向引物，其中所述通用反向引物的Tm值为59.1℃。4.一种通用反转录引物，用于对待测miRNA进行cDNA合成，所述通用反转录引物为以下方通式表示的核苷酸序列：R-(dT)nVN其中R为5’端的核苷酸序列且为SEQ ID NO:2，(dT)n为中间部分n个连续的胸腺嘧啶残基(thymine residue)，n为19，VN为3’端由核苷酸残基组成的序列，V为腺嘌呤残基(adenine residue)、鸟粪嘌呤残基(guanine residue)或胞嘧啶残基(cytosine residue)，N为腺嘌呤残基、鸟粪嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。5.一种引物设计方法，所述引物用于miRNA qPCR检测，包括：确认待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的序列相似度，当序列相似度低于90％时，以第一设计方法设计正向引物，所述第一设计方法包括：第一调整步骤，使正向引物与具有SEQ ID NO:2的通用反向引物之间的Tm值差异不超过2度，当正向引物的Tm值低于57℃时，在5’端依序地增加具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，以使正向引物的Tm值达到57℃至61℃；以及第一确认步骤，确认正向引物的二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔，其中当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，删减二聚体区域的正向引物序列，以避开形成二聚体的区域，并重新进行所述第一调整步骤及所述第一确认步骤，当序列相似度高于90％时，以第二设计方法设计正向引物及反向引物，所述第二设计方法包括：重叠设计步骤，比对待测miRNA与同物种中的其他miRNA之间的核苷酸差异位置，并使正向引物及反向引物的3’端的最后一个核苷酸残基设计至所述核苷酸相异位置上，若仍无法区分待测miRNA与同物种中的其他miRNA，将正向引物或反向引物再往前增加一个重叠的碱基，或将正向引物和反向引物同时再增加一个重叠的碱基；第二调整步骤，使正向引物与反向引物之间的Tm值差异不超过2度，当正向引物的Tm值低于55℃时，在5’端依序地增加具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，当反向引物的Tm值低于55℃时，在5’端依序地增加具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，以使正向引物与反向引物的Tm值达到55℃至61℃；以及第二确认步骤，确认正向引物及反向引物的二聚体的△G大于-7.5千卡/摩尔，其中当二聚体的△G小于-7.5千卡/摩尔时，更...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟铭，康诗婷，
申请(专利权)人：奎克生技光电股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71